對新型冠狀病毒實驗室檢測技術合理應用的再認識

歐 銅，張 兵，張秀明

（深圳市羅湖區人民醫院檢驗科，廣東 深圳 518001）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）疫情的全球大流行危害嚴重。新型冠狀病毒的實驗室檢測在COVID-19確診、病毒傳播鏈阻斷及疫情防控中發揮著重要作用。新型冠狀病毒基因組破譯后，基于病毒特異性基因序列研發的熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）核酸檢測技術，為COVID-19的確診提供了靈敏度高、特異性好的實驗室檢測方法。機體感染新型冠狀病毒后會發生特異性免疫反應，在血清中先后出現IgM、IgG抗體。血清學抗體檢測聯合核酸檢測可減少漏診，實時監測疾病的進展。人群普遍接種新型冠狀病毒疫苗后會產生“假陽性”，給血清學抗體檢測結果的解讀帶來了挑戰，但通過檢測血清中和抗體，有助于評估疫苗接種后的群體免疫力。新型冠狀病毒抗原檢測主要靶向病毒自身蛋白，雖靈敏度低于核酸檢測，但操作便捷，可快速獲得檢測結果，且不受疫苗接種影響。為了高效應對大規模核酸檢測，國家衛生健康委先后出臺了“混檢”與不同規格“混采”的技術指引與規范[1-3]。隨著疫情與常態化防控的持續，實驗室檢測技術也在更新迭代，對現有檢測技術的優劣和應用場景進行再認識與思考，有利于疫情的科學防控。本文在新型冠狀病毒實驗室檢測工作實踐的基礎上，結合文獻調研，對5個關鍵技術問題進行分析，并提出應用建議。

1 核酸檢測不同規格“混采”與“混檢”

快速篩查對控制新型冠狀病毒傳播至關重要。考慮到核酸檢測能力、效率和衛生資源壓力，國家衛生健康委分別于2020年7月21日、8月17日、2022年1月15日發布了《新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測技術指引》[1]《新冠病毒核酸10合1混采檢測技術規范》[2]和《關于印發新冠病毒核酸20合1混采檢測技術規范的通知》[3]，推薦使用稀釋混合檢測、10合1混采和20合1混采檢測，以加快新型冠狀病毒篩查效率，及時阻斷傳播鏈，節約社會資源。

實驗室稀釋混合檢測也稱為單采混檢。混采目前比較常用的是5合1、10合1或20合1的方式。任何現有的匯集檢測策略，無論是匯集樣本還是提取核酸，都不可避免地要稀釋病毒。一般來說，匯集樣本的數量越多，產生假陰性的可能性就越大。假設擴增效率為100%，按循環閾值（cycle threshold，Ct）（標本熒光強度達到檢測限需要擴增的循環數）大小與原始模板量之間的關系：濃度2倍稀釋，Ct值升高1.00；濃度4倍稀釋，Ct值升高2.00；濃度10倍稀釋，Ct值升高3.32。目前，新型冠狀病毒核酸檢測單人單管病毒保存液為3 mL，5合1混采管病毒保存液為3 mL，不影響病毒濃度；10合1混采管病毒保存液為6 mL，病毒濃度是單人單管的1/2，弱陽性標本有可能被漏檢；20合1混采病毒管保存液為12 mL，與單人單管相比病毒被4倍稀釋，弱陽性標本更有可能被漏檢。如果混采結果為陽性，則需對混采的幾個受試者暫時隔離，并重新采集單管拭子進行復核。存在的問題是，需要對所有人員重新單采檢測，使流調難度大大增加，而且所有樣本都要重新提取核酸重新檢測，有可能貽誤時機，造成病毒在人群中的傳播。雖然2合1混檢與10合1混采的靈敏度相同，4合1混檢與20合1混采的靈敏度相同，但混檢陽性時，實驗室只需要對原樣本單獨提取核酸和檢測即可，可在短時間內鎖定陽性樣本，極大地方便了后續的流調工作，防控效率提高，但對醫療機構來講，檢測成本會相應增加。

羅穎等[4]提出了一種聯合混采與混檢的混合樣本池策略，能夠在單一實時熒光定量PCR檢測孔中準確地篩查超過90個樣本，同時保持極低的假陰性率，適用于COVID-19發病率低地區的大規模篩查和監測。董宏杰等[5]在新型冠狀病毒混合檢測中，采用注射器純化柱法從全部樣本的混合保存液中提取核酸，稀釋混樣檢測時，可將混合人數上限由20提高到50。

綜上所述，從流調效率來講，混檢的防控效果要優于混采；從節省檢測成本的角度出發，混采優于混檢。不同品牌的檢測試劑盒性能有所不同，建議選擇靈敏度較高的逆轉錄PCR試劑；目前的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的陽性判讀Ct值一般為40，整個反應擴增循環數為45，探索Ct值在38～40的樣本，混采或混檢后，能否在40～45個循環內形成S型擴增曲線具有重要的研判價值。無論是混采，還是混檢，都可提高總體檢測效率，有助于疫情的防控。但應注意的是，隨著社區病例數的不斷增多，單個樣本的檢測需求量也會增大，而混合檢測并不能代替這種需求。

2 病毒變異對核酸檢測性能的影響

核酸檢測依賴于寡核苷酸（引物和探針）與病毒基因組中各自靶序列之間的特異性雜交，通過熒光定量PCR儀進行擴增，實現對病毒的檢測。基于早期大流行傳播的新型冠狀病毒株序列，引物和探針靶向的RNA序列可以位于編碼結構蛋白[包膜（envelope，E）蛋白、刺突（spike，S）蛋白、核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白]的基因中，或者位于開放閱讀框（ORF1ab）中。隨著疫情的全球大流行，已出現了不少傳播力、致病力和免疫原性各異的病毒變異株[6]。大多學者認為，現有的核酸檢測試劑盒大部分都是針對新型冠狀病毒2個及以上基因設計多組特異性引物與探針，只要其中1組引物與探針檢測成功即判定為可疑陽性，新出現的變異恰好都在各組引物上的概率很低，因此核酸檢測試劑盒受病毒變異的影響不大[7]。針對我國8 488家實驗室開展的新型冠狀病毒Delta變異株核酸檢測室間質量評價結果顯示，同濃度水平的Delta變異株和非變異株樣本符合率差異無統計學意義（P＞0.05），提示Delta變異株未影響我國現有核酸檢測試劑的適用性[8]。有學者使用瑞士羅氏公司核酸試劑檢測時發現，雖然8例26340C＞U突變的樣本E基因全部漏檢，但ORF1ab基因均被檢出[9]。也有學者認為，ORF1ab、S、E和N靶基因的突變可能會干擾逆轉錄PCR檢測的特異性，但大多是基于生物信息學的分析，不能真實反映臨床應用中的診斷性能[10-12]。因此，在資源有限時，為了避免新型冠狀病毒變異株的某一突變位點引起靶標基因檢測假陰性結果，建議實驗室使用針對新型冠狀病毒2個及以上獨立的基因區域進行檢測的試劑。同時，應及時使用不同品牌的核酸檢測試劑對單靶標陽性的核酸標本進行復核[13]。

3 核酸檢測試劑“內源性”和“外源性”內標的優劣

內標為同一反應體系中與靶序列共同檢測的一段非靶序列分子，用于監控檢測流程。內標有2種形式，一種是利用天然樣品中含有的基因序列（內源性內標），另一種是在檢測過程中人工添加的外源性序列（外源性內標）。

內源性內標通常選擇不同個體間序列保守且在各組織與細胞中表達相對穩定的基因，如GAPDH、β-actin、18sRNA等管家基因。內源性內標與靶基因處理程序完全相同，具有監控采樣、運輸、核酸提取與擴增全流程優勢，但人體細胞或組織與病毒顆粒存在一定的基因提取效率差異，且環境樣本中因無人體組織或細胞，無法對內源性內標進行平行檢測。外源性內標根據非靶序列存在的形式常分為2種：一種是直接添加不會干擾靶序列擴增的人工合成非靶序列在擴增反應體系中與模板一起擴增，監測擴增過程；另一種是人工合成的假病毒，如MS2噬菌體，在核酸提取前被加入到提取體系中，假病毒包被的非靶序列內參參與核酸提取與擴增，監控檢測過程。外源性內標無法監控采樣與運輸過程，但因其與靶序列的存在形式相似，能更精細地監測提取與擴增過程，對環境樣本同樣有效。

目前的大規模篩查多采用5合1、10合1混采檢測，部分地區已采用20合1混采檢測，1管混采標本，無論是5合1、10合1，還是20合1，只要其中1個樣本采樣合格，整管樣本利用內源性內標進行采樣-檢測全流程監測，其檢測結果即為合格，這使內源性內標的監控采樣至擴增全流程的優勢無法發揮。內源性內標只針對單采樣本，如隔離點、封控區的重點人群采樣，才能體現出全流程監控的優勢。雖然在大規模核酸檢測過程中，因混采技術的使用，內源性內標無法有效監測采樣過程，但可節省添加內標的實驗環節，在大批量樣本檢測過程中，可減少實驗室工作量，快速出具報告。外源性內標在進行環境樣本檢測方面具有一定優勢，因環境樣本中不存在內源性內標，對應的內源性內標試劑無法檢測到內標，即無法監測提取與擴增過程，而在每份樣品中加入等量的外源性內標進行提取與擴增，因內標添加量穩定，擴增曲線趨于一致，可監控每個樣本提取與擴增情況。

綜上所述，外源性和內源性內標各有優劣，目前尚無文件明確哪種更好，獲得我國國家藥品監督管理局認證的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒既有采用內源性內標的方式，也有采用外源性內標的方式。因此，在檢測中可根據實驗室的不同需求與應用場景靈活選擇，綜合應用。

4 抗原檢測的意義與應用場景

隨著具有超強傳播能力的奧密克戎（Omicron）毒株的出現，國務院聯防聯控機制綜合組及時優化了疫情防控策略，印發了《新型冠狀病毒抗原檢測應用方案（試行）》[13]，開始推進“抗原篩查、核酸診斷”的監測模式”。同時，國家衛生健康委和國家中醫藥管理局也發布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》[14]，將抗原檢測作為核酸檢測的補充。

抗原檢測試劑的應用依賴于診斷性能、COVID-19流行率、感染癥狀及標本質量等多種因素。世界衛生組織在針對新型冠狀病毒感染診斷的抗原檢測指南中指出，基于新型冠狀病毒自檢快速抗原檢測的使用，其臨床性能與專業快速抗原檢測相當，與核酸檢測相比，快速抗原檢測應滿足最低性能要求，即敏感性≥80%，特異性≥97%[15]。截至2022年4月12日，我國國家藥品監督管理局批準的抗原檢測試劑盒已增至34個。德國保羅埃利希研究所對歐盟市售的122種抗原檢測試劑進行了性能評估，結果顯示，以標本PCR檢測結果（Ct值）≤25，敏感性＞75%作為產品合格標準，不同品牌試劑的敏感性差異大，其中有96種試劑滿足要求，26種試劑敏感性為0%～58.8%，20種試劑檢測Ct值≤25的標本時，敏感性可達100%，Ct值為25～30時，敏感性＞75%[16]。目前流行的新型冠狀病毒感染以無癥狀為主。有研究結果顯示，抗原檢測試劑篩查無癥狀感染者的敏感性為28.8%～51.5%，特異性89.2%～99.5%，以1%感染流行率推測抗原試劑陰性預測值＞99%，陽性預測值＜50%[17]。提示在我國新型冠狀病毒感染流行率低的區域不適合進行大規模抗原篩查。抗原檢測對傳染期的病毒具有較高敏感性，感染者一般在感染第3～7天病毒載量最高，因此抗原檢測更適用于處于感染到發病1周內的人群的篩查，有利于“早發現、早診斷、早隔離、早治療”的防控需求，可以實現早期分級管理。由于抗原檢測在15～30 min即可出結果，即采即檢，與核酸檢測相比，可大大提高檢測效率，且方便、快捷、成本低，普通民眾可居家檢測，便于分流有新型冠狀病毒核酸檢測需求的人群，有效緩解核酸檢測壓力。作為自測試劑，采樣的質量是抗原檢測關鍵的影響因素，但隨著抗原試劑的推廣使用，大量視頻宣傳等均對采樣操作進行了標準示范，有助于保障居民居家隔離抗原試劑檢測的準確性。

結合應用方案、國內外疫情防控政策及抗原應用條件，新型冠狀病毒抗原檢測可考慮應用的場景包括：（1）基層醫療機構發熱門診的快速分診，尤其適用于伴有呼吸道、發熱等癥狀且出現癥狀5 d以內的人群；（2）存在聚集性暴發的潛在風險的場景，如集中在封閉或半封閉環境的人群，包括學校、療養院、游輪、監獄、工作場所和宿舍；（3）重點場所的監測，如人流密集的機場、火車站、海關、定點隔離機構等，采用抗原聯合核酸篩查定期監測，可前移篩查關口；（4）封控區、管控區、居家隔離人員等的篩查，可提高封控和管控社區的管理效率。新型冠狀病毒抗原檢測方法學包括熒光免疫層析、膠體金、乳膠法等，除手工檢測外，還有便攜式儀器檢測和自動化檢測設備被相繼研發出來，可適用不同場景。因此，在常態化疫情防控中，抗原檢測有利于有癥狀或潛在感染高風險人群的快速篩查和分流。

5 疫苗接種后抗體檢測的價值

抗體是指機體由于抗原的刺激而產生的具有保護作用的蛋白質。機體感染新型冠狀病毒后，先產生血清特異性抗體IgA，發病約1周后產生IgM抗體，最后出現IgG抗體，IgM抗體水平增高提示近期急性感染，IgG抗體水平增高提示既往感染[18]。在接種新型冠狀病毒疫苗后，機體會產生“中和抗體”，中和抗體來源于IgM、IgG和IgA中的一部分，通過結合病毒表面S蛋白，阻斷其與細胞表面血管緊張素轉換酶2受體的結合，進而阻止病毒侵入細胞[19]。

目前，國內外已有多種新型冠狀病毒抗體檢測試劑獲批上市，包括總抗體、IgA、IgM、IgG和中和抗體檢測試劑。隨著對疾病認識的深入和診療經驗的積累，為進一步加強早診、早治方針的實施，《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》[14]明確規定：未接種新型冠狀病毒疫苗者新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體均為陽性，可作為疑似病例確診的證據之一。特異性抗體可作為COVID-19輔助診斷的指標，可聯合核酸檢測對疑似病例進行分析[20-21]，還可用于COVID-19患者的治療監測[22-23]。

截至2022年4月11日，全球新型冠狀病毒疫苗的接種率為64%，我國接種率高達88%[24]。因此，隨著全球新型冠狀病毒疫苗接種的普及，中和抗體檢測可評估疫苗接種后的免疫效果，包括參與輔助疫苗開發、疫苗免疫效果評估、疫苗保護力閾值研究和疫苗持久性研究。TENBUSCH等[25]對接種不同類型新型冠狀病毒疫苗后的人群進行了中和抗體的評估，發現異源接種加強針疫苗的效果更優。TADA等[26]分析了基于mRNA和腺病毒載體疫苗產生抗體對變異假型新型冠狀病毒的中和能力，發現接種BNT162b2和mRNA-1273后產生的抗體對新型冠狀病毒多種變異株表現出適度的中和抗性，而接種Ad26.COV2.S后產生的抗體的中和滴度較低。DORIA-ROSE等[27]通過中和抗體的動態監測，對新型冠狀病毒疫苗接種效果的持久性進行評估，發現接種疫苗200 d后，中和抗體滴度仍較高。

綜上所述，在未接種新型冠狀病毒疫苗人群中，特異性IgG、IgM抗體陽性對核酸檢測陰性的COVID-19疑似病例的確診具有重要意義。在接種了新型冠狀病毒疫苗人群中，病毒中和抗體的動態監測具有重要參考價值，有助于確定疫苗保護力閾值，且對中和抗體水平進行更長時間的持續定量檢測，還有助于評估是否需要加強免疫。

6 結語

隨著疫情的持續，核酸檢測、抗體檢測、抗原檢測這3種實驗室檢測技術在新型冠狀病毒篩查與COVID-19診斷中相互結合，逐步完善，以適應不同階段疫情防控的需求，為疫情防控提供實驗室數據支持。（1）核酸檢測敏感性和準確性最高；（2）高滴度病毒載量條件下快速抗原檢測有助于提高診斷效率，在大流行時期或者潛在感染率較高的重點場所與封閉管控區域，抗原檢測可快速分流人群，降低聚集感染風險；（3）無癥狀感染者主要來自密接或重點關注人群，為減少因采樣部位病毒載量不足導致的漏檢，聯合特異性IgM、IgG抗體檢測來動態監測機體免疫反應具有重要意義。COVID-19已在全球流行近3年，建立群體免疫屏障有助于早日結束疫情大流行，在與病毒賽跑的過程中，各種實驗室檢測技術的合理應用是關鍵。