干細胞移植在糖尿病下肢血管病變治療中的應用進展

李慧靈

（桂林市中醫醫院內分泌科，廣西 桂林 541002）

糖尿病下肢血管病變（Lower extremity vascular disease，LEVD）是指糖尿病患者下肢血管尤其是中、小動脈出現的慢性進行性狹窄和閉塞。此病常伴有下肢感覺神經損傷。糖尿病LEVD 患者的早期癥狀主要是受累肢體出現冷感和疲勞感，多數患者缺乏外周動脈疾病的典型前期癥狀，如間歇性跛行和靜息痛。因此，糖尿病LEVD 可能在患者出現明顯組織病變前無法明確診斷[1]。糖尿病LEVD 若持續進展，最終可導致患者發生糖尿病足潰瘍和壞疽，而糖尿病足潰瘍和壞疽是導致非創傷性截肢的主要原因。LEVD 不是糖尿病患者特有的并發癥，但糖尿病患者LEVD 的發生率明顯高于非糖尿病患者。目前臨床上治療糖尿病LEVD 的方法較多，包括藥物治療、血管搭橋術、介入治療、血運重建術等。但藥物治療的療效不顯著，而血管搭橋術和介入治療的療效受限于患者術后較高的下肢血管再狹窄率。生長因子、自體富血小板凝膠和局部二氧化碳的使用被認為有利于促進糖尿病足患者潰瘍面的愈合，但最新的糖尿病慢性足潰瘍干預指南明確表示不支持這一治療方式[2]。此外，由于手術的風險高，因此有20% 以上的慢性肢體缺血患者因年老體弱或伴有彌漫性疾病、晚期疾病等自身原因而無法接受血管內介入治療或血運重建術[3]。由此可見，探索更有效的治療糖尿病LEVD 的方法勢在必行。近年來，基于干細胞“治療性血管生成”特性的干細胞移植技術已成為臨床上治療糖尿病LEVD 的研究熱點。具有自我更新和多向分化增殖能力的干細胞在體內、體外的特定環境下均可定向誘導生成血管內皮細胞、平滑肌細胞等多種特定細胞，參與血管再生、組織損傷修復等過程，從而可恢復和改善下肢血流，達到治療糖尿病LEVD 的目的。本文回顧了目前報道的采用干細胞移植療法治療糖尿病LEVD 的相關文獻，概述了干細胞的類型及干細胞移植治療下肢血管病變的相關進展，以獲得關于干細胞移植作為糖尿病LEVD有效治療手段的可靠證據，為下肢缺血性疾病的治療提供參考和借鑒。

1 干細胞類型

干細胞是一類具有無限自我更新和多向分化能力的“萬能細胞”。一般來說，可根據干細胞的發育階段將其分為兩大類，即胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESCs）和成人體細胞（adult stem cells，ASCs）。ESCs 亦 稱 為 誘 導 多 能 干 細 胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），具有全能性，可分化成成人身體器官或組織的任何細胞。ESCs 一般是在受精后4 ～5 d 內從胚泡內部的細胞團中獲得的。ASCs具有組織特異性，其分化潛力具有局限性，一般存在于各類器官中，其在特定器官或組織中只能分化為該器官或組織的特殊細胞類型。ASCs 根據組織來源可分為造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、神經干細胞（neural stem cell，NSCs）和肌肉干細胞（muscle stem cell，MuSCs）等[4]。ASCs 因 具 有 分 化成各種特定細胞類型的內在潛力，且一直存在于人體組織內部，因此一直被認為是再生醫學中的關鍵治療元素，在干細胞移植治療中受到了廣泛重視。目前用于移植的干細胞通常有以下幾種：iPSCs、HSCs、骨髓單核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMMNC）、 內 皮 祖 細 胞（endothelial progenitor cells，EPCs）及包括臍帶、臍血和骨髓等來源的MSCs。這些干細胞均有多向分化的潛能，可用于不同組織和器官的移植。

2 干細胞移植治療的現狀

1997 年有學者首次從血液中分離出EPCs，并發現其可以發育成血管內皮細胞，促進血管的重建。之后通過動物實驗發現，EPCs 具有定向歸巢的特性，能主動趨向移植肢體的局部缺血和血管損傷部位，并通過旁分泌血管生長因子〔如血管內皮生長因子（VEGF）等〕促進新生血管的形成，建立側支循環，使缺血肢體的血液流動得到改善，從而改善肢體缺血的狀態。2002 年，日本學者Tateishi-Yuyama E等首次在人體試驗中通過骨髓干細胞移植治療糖尿病LEVD，結果表明干細胞具有“治療性血管生成”的作用，能明顯改善和恢復糖尿病LEVD 患者下肢的血液灌流量，取得了令人滿意的療效[5]。國內夏穩伸等[6]通過對13 個干細胞移植治療糖尿病LEVD 的隨機對照試驗（RCT）進行薈萃分析，發現干細胞移植組患者相比常規治療組患者的踝肱指數（ABI）、經皮氧張力（TcPO2）、靜息痛、肢體冷感、側支血管新生及截肢率均有不同程度的改善。

2.1 自體骨髓干細胞移植

骨髓是人體中最豐富的干細胞池。BM-MNC 是具有自我更新和多向分化潛能的原始骨髓細胞。成年個體的BM-MNC 中包含骨髓來源的MSCs（BMMSCs）、EPCs、HSCs 等龐大的干/ 祖細胞成分，其中EPCs 的含量約占3%，超過外周血的15 倍。具有CD34+標記的BM-MNC 是EPCs 的主要來源，BMMNC 在特定條件下可分化為血管內皮細胞、平滑肌細胞，成纖維細胞等，且移植后可通過旁分泌VEGF等血管生長因子促進新生血管的形成和缺血損傷的修復。對后肢缺血家兔模型進行BM-MNC 移植4 周后，通過血管造影檢查發現，局部移植BM-MNC 可產生功能性EPCs，有效促進家兔缺血后肢的血管生成和側支血管形成。而對后肢缺血糖尿病大鼠模型進行實驗發現，將骨髓干細胞局部肌內注射至大鼠的缺血肢體后，在其缺血后肢中實現了血液灌注的恢復。提示BM-MNC 誘導的治療性血管生成可能是糖尿病LEVD患者的一種安全有效的治療方法。馬海濤等[7]對60例糖尿病LEVD 患者的36 條患肢進行BM-MNC 移植，移植20 周后經血管造影證實患者的ABI、TcPO2和血氧水平（BOLD）較移植前均有不同程度的升高，其缺血下肢的血流灌注量得到明顯改善和恢復，新生血管和側生血管形成明顯增加，其截肢手術率明顯降低。谷涌泉等[8]對糖尿病LEVD 患者實施自體BMMNC 移植治療，發現治療后患者的疼痛明顯緩解，ABI 和TcPO2均明顯升高，部分患者的間歇性跛行癥狀較治療前明顯好轉，其截肢率和截肢平面明顯降低。同時，該研究還證實了用經下肢動脈導管注射和肌內局部注射這兩種不同的自體BM-MNC 移植方法治療糖尿病LEVD 的效果并無顯著性差異。這為自體骨髓干細胞移植治療糖尿病LEVD 的臨床應用提供了有力證據。存在于各種組織器官中的MSCs 具有多向分化潛能，通常表達CD90、CD105 和CD73 標記，在干細胞移植治療方面受到了廣泛關注。臨床上治療糖尿病足慢性不愈合潰瘍最有效的方法之一就是自體植入BM-MSCs。有學者在大鼠下肢缺血模型中分別進行BM-MSCs 移植和BM-MNC 移植，結果表明BMMSCs 移植較BM-MNC 移植能更有效促進新生血管的形成。劉璠等[9]對比了用自體BM-MSCs 移植和BMMNC 移植治療糖尿病LEVD 的療效，結果顯示，隨訪24 周后BM-MSCs 組患者的無痛步行時間、ABI、TcPO2、肢體血流灌注量和潰瘍愈合率等指標相較于BM-MNC 組患者提升更為顯著。表明在促進糖尿病LEVD 患者的下肢血流灌注和足部潰瘍愈合方面，BM-MSCs 移植可能比BM-MNC 移植具有更好的耐受性和有效性。

2.2 外周血干細胞移植

雖然目前認為自體骨髓干細胞移植具有細胞采集操作簡單、方便直接及費用較低等優勢，但同時也存在需要局部麻醉、骨髓采集創傷較大、采髓量高、對患者身體狀態要求較高及危險性較大等缺點，限制了該治療方法的臨床使用。外周血干細胞移植（peripheral blood stem cell，PBSCs）是通過應用粒細胞集落刺激因子（G-CSF）動員骨髓干細胞從骨髓分泌到外周血循環中，從而提高外周血中EPCs 和HSCs數量，以達到干細胞移植要求的一種治療方式。正常狀態下，外周血中EPCs 的含量極低，經過G-CSF 動員后外周血中EPCs 的含量可提高1% ～10%，再通過細胞分離機將外周血循環中的PBSCs 分離出來，用于干細胞移植。早期通過糖尿病肢體缺血動物模型證明，進行EPCs 移植治療能有效改善糖尿病肢體缺血動物模型缺血肢體的血流灌注，促進其潰瘍面的愈合。盧愛俊等[10]研究發現，糖尿病LEVD 患者在接受PBSCs 移植治療后，其ABI、TcPO2等客觀指標均得到提升，間歇性跛行得到改善，潰瘍面愈合。提示通過PBSCs 移植可增強糖尿病足潰瘍患者下肢的血液供應。研究表明，CD34+細胞似乎是一個豐富的EPCs群體，是治療潰瘍的良好候選細胞。上述研究均表明PBSCs 移植是治療糖尿病LEVD 的一種簡單、安全、有效的新方法。陳明衛等[11]比較了用自體BM-MNC移植和PBSCs 移植治療糖尿病LEVD 的效果，發現用這兩種干細胞移植療法治療糖尿病LEVD 的效果相當。然而，PBSCs 移植療法在應用時由于需要長時間以G-CSF 動員骨髓單核細胞的形式進入外周血循環，因此容易會造成血液的黏稠度升高，引起血管內血栓形成，進而可增加患者心腦血管疾病的發病風險[12]。因此，在整個骨髓動員過程中，應注意為患者采取抗凝措施，以預防其出現心腦血管并發癥。

2.3 臍血干細胞移植治療

臍血干細胞（bilical cord blood stem cell，UCB）因其來源豐富且制備便利，現已成為HSCs 和EPCs的重要替代來源，越來越受到學者們的關注。臍血中CD34+細胞的含量為成人外周血中該細胞含量的10倍，且其增殖分化能力明顯高于骨髓干細胞，產生EPCs 的能力更強。文獻報道，UCB 移植可有效提高兔后肢動脈球囊損傷模型血液中一氧化氮（NO）的濃度，抑制血管內膜的增生，改善其損傷血管內皮的功能[13]。于鳳泉等[14]研究證實，應用UCB 移植聯合介入治療可有效改善糖尿病LEVD 患者的VEGF、ABI、TcPO2和肢體冷感等客觀指標，且相較于單獨應用介入治療，聯合應用UCB 移植與介入治療起效更快，且療效更持久。馬紅芳等[15]研究表明，UCB 移植可明顯促進糖尿病LEVD 患者新生血管和側支循環的形成，改善受損血管內皮的功能，降低介入治療后再狹窄的發生率，且UCB 移植與血管介入治療兩者聯用相比單獨應用介入治療的療效和遠期預后更佳。

3 存在的問題與展望

用干細胞移植療法治療糖尿病LEVD 可有效改善和恢復患者的下肢血流灌注，促進血管新生。然而，大多數關于該療法的研究都是通過糖尿病LEVD 動物模型進行的基礎研究，關于該療法的臨床研究仍然太少。鑒于用干細胞移植療法治療其他慢性疾病（如高發病率的潰瘍等）具有巨大的治療潛力，因此有必要在人體受試者中進行更多的臨床試驗來證明其安全性、有效性和耐受性。同時，盡管自體干細胞是干細胞移植治療中最常用的細胞類型，但未來更多地探索iPSCs 和異基因或異種干細胞移植仍是十分必要的。通過G-CSF，有助于動員骨髓干細胞分泌到外周血中，并促進傷口的愈合，因此建議將其作為外周血干細胞移植治療的輔助手段。對于需要血運重建的糖尿病LEVD 患者，在行干細胞移植治療的同時聯合實施血管成形術是一種很有前景的治療方式，但干細胞移植是否能被用作血管成形術的輔助治療手段仍有待確定。此外，在干細胞移植治療中，干細胞的數量和質量尤為關鍵。在許多干細胞移植治療方案中，移植在患者體內的干細胞存活率很低，這是制約該治療方案臨床應用和推廣不可忽視的障礙。除了細胞在體內存活的問題外，干細胞移植治療的局限性還包括應用來自胚胎和臍帶血異體干細胞的相關倫理問題、致畸潛力、對骨髓來源細胞侵入性收獲技術的需求及免疫原性等問題。此外，不同研究之間的干細胞來源、移植細胞數量和細胞給藥途徑也不相同。考慮到干細胞的異質性，還有待大量高質量的臨床隨機對照試驗對干細胞移植治療的安全性、有效性及遠期療效予以證實，且建立一套行之有效的規范化治療指南和完整、客觀的療效評價系統也勢在必行。