地中海貧血實驗室篩查和診斷方法進展

黃來鳳

（天等縣婦幼保健院 廣西崇左 532800）

地中海貧血（以下簡稱“地貧”）是一種自體隱性遺傳疾病，往往由于親代自身遺傳的α、β珠蛋白基因缺失，使子代血紅蛋白（Hb）中一種或多種珠蛋白鏈缺如或不足，引發貧血問題。地貧好發于東南亞地區，在我國廣西、廣東地區較為多見。地貧根據缺失的珠蛋白鏈種類和程度進行分型，一般以α-地貧與β-地貧較為常見與典型。這其中α-地貧患病率更高。若親代雙方均為同型地貧攜帶者，則子代有25%的幾率遺傳、發展為重型地貧[1]。針對此類情況，建議采取人工流產，實現優生優育。為了及早檢出地貧問題，予以產婦甚至孕前檢測者更科學的妊娠指導，就需要開展針對地貧的孕前、產前檢查工作。本次研究，主要探討地貧的實驗室篩查技術研究現狀。基因檢測一直是地貧診斷的金標準，因此本文還就地貧的基因檢測研究現狀進行總結，詳情見下。

1 原則

在地貧問題的預防控制上，臨床主張孕前檢查，必須接受產前檢查，以及時發現問題妊娠并予以干預，響應優生優育政策。關于地貧的防控，臨床主張先篩查、后診斷。篩查技術分多種，且相較于診斷技術更加安全、高效、經濟性佳；但不足之處同樣存在，即有一定的誤漏診幾率。因此針對篩查示陽的受檢者，建議接受進一步的基因診斷，以更好地確診是否為地貧基因缺如人群。

基因檢查的優勢在于準確性高，但缺點在于費用同樣高昂，且技術的開展十分依賴專業設備與人員，部分基層醫療單位往往不具備基因檢查條件，因此基因檢查不適用于地貧的“篩查”，建議作為地貧防控工作的確診工具。

2 篩查試驗

2.1 紅細胞形態檢查李敬[2]在其研究中證實，地貧患者的血液涂片普遍存在紅細胞體積不一致的問題，甚至紅細胞存在大量的不規則形態，最典型的有靶形、淚滴形、嗜堿性點彩紅細胞等。靶形紅細胞屬于十分常見的不規則形態，微觀下顯示為中心顏色深、周圍顏色淺、邊緣顏色深的“標靶”形狀，十分好辨別。在紅細胞檢查時，若發現大量的靶形紅細胞，則需要警惕樣本是否源自地貧患者。

2.2 血細胞分析血細胞分析因其操作便捷性及較高的地貧檢出效果，獲得臨床廣泛運用。近幾年關于血細胞分析檢出地貧的研究報道，多傾向于結合式的應用，即在其他檢測基礎上聯合血細胞分析行綜合診斷。鄭琳等學者[3]所撰研究主要觀察了平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)與平均紅細胞體積(MCV)兩種血細胞分析指標在地貧檢查中的診斷效能，發現MCH、MCV 的診斷靈敏度、特異度均超90%，另外研究人員建議將MCH、MCV 兩指標聯合用于地貧的檢測中，可獲得最佳診斷效能。臨床其他可用的血細胞分析指標還包括紅細胞壓積（HCT）、紅細胞體積分布寬度（RDW）等。國際地中海貧血協會還推薦MCH 低于27Pg、MCV 低于78fI 為地貧篩查的截斷值，該標準為臨床篩查地貧提供了規范。

2.3 紅細胞滲透脆性實驗該實驗主要是通過觀察紅細胞在不同低滲透壓鹽水中的抵抗力，以評估受檢紅細胞是否存在體積變小與形變的問題。當受檢紅細胞表面積與體積之比提升，其在低滲鹽水中的吸水膨脹適應性越大，脆性越低，因此紅細胞滲透脆性實驗能夠一定程度上鑒別地貧人群。馮志剛等學者[4]的研究顯示，紅細胞滲透脆性實驗篩查地貧的敏感度可達78.6%，特異度可達94.1%，準確率可達91.9%，證實該篩查技術的應用有效性。但考慮到偏低的敏感度，建議臨床將紅細胞滲透脆性實驗與地貧的其他篩查技術聯合使用，以期提升檢出效能。

2.4 血紅蛋白組分析在地貧患者的篩查中，分離鑒定、定量分析Hb 有極高的診斷價值。血紅蛋白組分析的主要對象為HbA2、HbH、Hb Bart’s 等,主要技術為瓊脂糖凝膠電泳、毛細管電泳法、高效液相色譜法等。瓊脂糖凝膠電泳是在堿性環境下，Hb經電場分離后染色，對Hb 瓊脂糖進行定量分析[5]。毛細管電泳法中各種Hb 將毛細管作為分離管道，在電場作用下，受不同移動速度的影響，進而實現物質分離。毛細管電泳法具備操作便捷、安全經濟等優勢，同時結果分辨率高，只需少量樣本即可檢查。目前毛細管電泳法已成為孕前、產前地貧篩查的主要檢查技術。林開顏等學者[6]總結提出，相較于血常規篩查，毛細管電泳法在α-地貧中的陽性檢出率更高；而針對β-地貧篩查質量，毛細管電泳法與血常規篩查無明顯差異。高效液相色譜法是利用離子交換樹脂作為固定相，高壓環境下，機體血紅蛋白理化特性存在差異，因此在分離柱的停留時間不同，基于此實現Hb 分離。林青等學者[7]所撰研究對比了高效液相色譜法與血細胞分析技術在地貧檢查中的準確率，結果高效液相色譜法顯著高于后者。陸瑩[8]所撰研究證實，相較于血常規分析，高效液相色譜法的診斷質量更高。總之，各種血紅蛋白組分析技術在地貧篩查中的檢出效能理想，值得關注。

3 基因檢測

3.1 Southern 印跡雜交該檢查技術的診斷機制是將受檢者的基因組DNA 提取，再將通過限制性內切酶消化的DNA 片段以瓊脂糖凝膠電泳進行分離，并轉移至硝酸纖維膜上，再和放射性核素標記的RNA、DNA 探針雜交。酶解的DNA 片段位置與大小經由放射自顯影技術檢測。技術雖然具備一定的地貧檢出率，但技術的開展環節十分眾多，耗時費力，因此使用受到一定局限。但該項技術尤其適用于α-地貧的檢測與大片段基因缺失的檢測，因此被視為其他基因診斷的確診實驗。近幾年國內缺乏Southern 印跡雜交技術檢查地貧的研究報道，使后人的循證受阻。未來還需持續關注Southern 印跡雜交的應用進展。

3.2 多重PCR 和多重斷裂點PCRPCR 的檢查機制是經由DNA聚合物延伸引物，通過變形、退火、延伸等各項環節，完成特定DNA 片段的體外擴增。技術本身的應用較為便捷，對基層醫院的推廣較為友好。多重PCR 是PCR 技術的延伸產物，即在原本的PCR 基礎上增加超過2 對的引物，并將多個核酸片段擴增。如此，可憑借各突變點特異性擴增產物，對檢測結果進行判定，尤其在缺失型α-地貧與靜止性α-地貧中檢出效果好。多重斷裂點PCR 技術的檢查機制是通過在基因缺失區域設計2～3 對引物，并觀察是否出現PCR 特異性擴增片段，進行基因型的判斷。當然，醫師也可根據正常的對照片段與陽性擴增片段，對受檢者的地貧進行定性，界定其究竟是正常人群，抑或地貧雜合子、純合子。該項技術在α-地貧的診斷中應用率較高，檢出結果理想[9]。

3.3 PCR-反向點雜交法（PCR-RDB）駱明勇等學者[10]的研究中總結，經PCR-RDB 檢查，165 份樣本中PCR-RDB 檢測結果與已知基因型完全一致，肯定了該技術在地貧診斷中的地位。PCR-RDB 的檢查機制是通過在支持膜上將已知的寡核苷酸探針一一固定，再將PCR 產物加入其中，行液相探針雜交操作。PCR-RDB 技術能夠對多種點的突變情況進行檢查。學者們認為，PCR-RDB 技術本身檢出效能理想、檢測結果精準，同時對標本的消耗少，因此十分適用于臨床推廣。目前，PCR-RDB 主要應用于β-地貧的基因檢測中，但技術開展過程中步驟較為繁瑣，且最終結果的判定還會受到醫師主觀判斷上的誤讀，因此需要加強學習，只有這樣才能保障PCR-RDB 檢出結果的準確性與高效性。另外，針對PCR-RDB 復核結果存疑者，建議進行復查。

3.4 基因芯片經由微電子技術、微加工處理的方式，在固相介質上，將已知序列的核苷酸探針固定其中，和已經被同位素、熒光素標記的核酸序列雜交。基于激光共聚焦顯微鏡，觀察反應點熒光位置和強弱，得到一組完整互補的探針序列，并基于此將靶核酸序列重組。基因芯片的檢查優勢在于高效、便捷、靈敏性高，但經濟性欠佳，現階段的制作成本難以支撐基因芯片在臨床的大規模使用[11-12]。

4 小結

本文介紹了以紅細胞形態檢查、血細胞分析、紅細胞滲透脆性實驗、血紅蛋白組分析為典型的地貧篩查技術，以及以Southern 印跡雜交、多重PCR、多重斷裂點PCR、PCR-RDB、基因芯片為典型的地貧基因診斷方法；并基于前人研究文獻，概述了地貧篩查技術與基因診斷方法在臨床的應用價值。通過搜集前人資料，筆者認為，各種地貧檢測方法均有其應用場景，具體的檢測方案選擇，既要結合當下檢測單位的自身條件，也要結合受檢者的經濟實力，在此基礎上，選擇最適合的檢測方案，才是提升檢出準確率、輔助醫方妊娠指導工作開展的重要基礎。未來筆者還將繼續關注地貧檢測與診斷的研究動態，不斷提高自身學術視野，更好地將理論與實踐結合，響應國家優生優育政策，為群眾服務。