小鼠心臟移植排斥反應抑制的研究進展*

郭 磊 唐一鑫 魏 然 辛本凱 朱翠琳 張紀周

(1吉林大學基礎醫學院 生物化學教研室，長春 130021)(2.吉林大學白求恩第二臨床醫院 心血管外科，長春 130022)

心臟移植是針對終末期心力衰竭患者進行的手術治療，患者術后盡管接受了適當的免疫抑制劑的治療，但仍會引發并發癥。當受體免疫系統通過啟動免疫反應對供體器官中的外來抗原作出反應時，就會發生心臟移植排斥反應(heart transplantation rejection, HTR)[1]。近年來，盡管圍手術期管理取得了進展，但同種異體移植排斥仍然是心臟移植后常見的并發癥，可導致同種異體移植物功能障礙和抗體介導的免疫排斥反應，并顯著損害患者的短期和長期預后[2]。

心臟移植動物模型是進行移植免疫學研究的重要實驗手段，小鼠心臟移植模型經過半個世紀的發展，已經形成了一系列完備的建立方法，其中以小鼠和大鼠的頸部和腹腔異位心臟移植模型最為常用[3-4]。本文就小鼠心臟移植后如何抑制其免疫排斥反應作一綜述。

1 小鼠心臟移植動物模型

建立大鼠和小鼠的心臟移植模型是研究移植排斥反應較為理想的選擇，其中，大鼠異位心臟移植模型所用實驗動物的體型大，血管粗，容易建立成功，而小鼠體型小，建立小鼠異位心臟移植模型難度較大。但是由于近交系小鼠品種較多，實驗成本較低，并有大量與之匹配的抗體和試劑，因此，小鼠心臟移植動物模型是研究移植免疫學常用的實驗手段。目前，建立小鼠心臟移植模型主要有兩種方法：頸部異位心臟移植術和腹腔異位心臟移植術。這兩種建立方法各具特點，可根據實驗需要選用。

1991年，Chen等[5]首次創建了小鼠頸部異位心臟移植模型，此模型通常使用20～30 g雄性BALB/c和C57BL/6小鼠進行手術。該模型主要優點有：小鼠頸部血管相對容易分離、手術創口小、感染率低、術后存活率高等。主要缺點有：小鼠頸部血管直徑細，對手術設備的要求較高，需要在至少30倍的手術顯微鏡下進行，手術難度大[3-4,6]。

目前，小鼠腹腔異位心臟移植手術方法多借鑒大鼠Ono法，并加以改進[7]。該模型主要優點有：小鼠腹腔空間大，方便手術操作，小鼠腹主動脈與頸總動脈相比血管直徑粗，在25倍手術顯微鏡下就可完成。主要缺點有：開腹手術創口大，感染概率高，并且腹部血管粘連緊密，血管分離難度較大[3-4,8]。

以上兩種小鼠心臟移植模型的構建方法，已經被廣泛地應用，基本滿足心臟移植后排斥反應和驗證免疫抑制藥物療效等實驗的需要。下面對抑制移植排斥反應的不同方法進行介紹。

2 抑制小鼠HTR的制劑

抑制小鼠HTR的制劑可以根據其作用免疫細胞的不同分為mTOR免疫抑制劑和阿司匹林、自組裝前藥納米顆粒、微小RNA-146a拮抗劑，下面分別介紹這些藥物對HTR的抑制作用。

2.1 mTOR免疫抑制劑

哺乳動物雷帕霉素靶標(mammalian target of rapamycinm,mTOR)于1991年首次被鑒定為釀酒酵母中雷帕霉素的靶標。mTOR在調節蛋白質合成和細胞生長中起重要作用，mTOR抑制劑對T淋巴細胞增殖具有良好的抑制作用，是移植后抗排斥反應常用的免疫抑制劑[9]。

mTOR抑制劑是器官移植受者的主要免疫抑制藥物。西羅莫司及其衍生物是常用的mTOR抑制劑。西羅莫司原名雷帕霉素，是一種天然大環內酯類抗生素，是吸水鏈霉菌的發酵產物。在細胞質中，mTOR復合物可分為兩個結構不同的分子復合物：mTORC1和mTORC2，雷帕霉素與FK506結合蛋白12(FK506 binding protein,FKBP12)形成復合物，然后與mTORC1結合，導致細胞周期停滯在G1期，抑制T淋巴細胞的增殖[10]。

Nakamura等[9]研究表明，通過給心臟移植的小鼠腹腔注射雷帕霉素(3 mg/kg，在術后第0、2、4和6天進行)，結果顯示雷帕霉素治療導致骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)的募集并增加誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達。免疫組織化學分析表明，雷帕霉素誘導表達iNOS的MDSCs遷移到同種異體移植血管內的內膜下空間，與未治療組相比，雷帕霉素治療顯著延長移植物存活時間。

2.2 阿司匹林

阿司匹林(乙酰水楊酸)是非甾體抗炎藥中最主要的成員，通過干擾環加氧酶II(cyclo-oxygenase II,COX II)治療炎癥、疼痛和發熱，并有效抑制前列腺素的合成。

已有研究報道阿司匹林通過不依賴COX的途徑作為樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)成熟和活化的抑制劑，抑制DCs的免疫刺激功能。此外，阿司匹林還抑制DCs產生細胞因子，使DCs處于免疫耐受狀態。即使存在刺激劑，阿司匹林處理的DCs的免疫抑制功能仍然保留[11-12]。大量臨床研究[13]表明，阿司匹林成功降低了心臟移植患者移植失敗的風險，延長了移植的生存期。在同種異位心臟移植小鼠模型中，腹腔注射阿司匹林后，阿司匹林通過影響核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路抑制DCs的成熟，并誘導效應T細胞的免疫低反應性，然后減弱心臟移植后的急性HTR。可以有效延長小鼠的同種異體移植物存活率。此外，阿司匹林與FK506協同可有效提高移植排斥反應的治療效果，表示阿司匹林與現有T細胞免疫抑制劑聯合應用可能是抑制HTR更好的治療方案[14]。

2.3 自組裝前藥納米顆粒

心臟移植后，為防止HTR，mTOR免疫抑制劑是最常用的治療手段，但傳統的免疫抑制劑具有半衰期短、利用度低和劑量限制性毒性等缺點[15]。這些缺點阻礙了移植物的長期存活。mTOR抑制劑PP242是一種新型的第二代三磷酸腺苷競爭性mTOR抑制劑，通過與三磷酸腺苷結合位點的相互作用有效抑制mTORC1/mTORC2的激活。為更好地抑制HTR，用二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)對mTOR抑制劑PP242進行化學連接，使其能夠在水溶液中自組裝成納米顆粒(DHA-PP242 nanoparticle,DPNP)。通過全身給藥的DPNP能夠在外周免疫器官內的巨噬細胞中積累，它能夠以不依賴巨噬細胞的方式抑制T細胞增殖，同時以依賴巨噬細胞的方式調節T細胞分化。DPNP可有效抑制同種異體小鼠心臟移植模型HTR的發展并顯著延長移植物存活時間[16]。與FK506相比，DPNP廣泛用于臨床器官移植治療，可以誘導更長的移植物存活時間，DPNP可以作為心臟移植后HTR的治療選擇。

2.4 微小RNA-146a拮抗劑

微小RNA-146a(microRNA-146a,miRNA-146a)拮抗劑通過調節調節性T細胞(regulatory T cells,tregs)功能，可以改善小鼠HTR。CD4+CD25+Tregs細胞特異性表達轉錄因子叉頭框蛋白3(forkhead box protein 3,Foxp3)，是一種具有免疫調節功能的特殊群體，可抑制自身抗原的過度激活，監測淋巴細胞的擴增，并有效抑制過度的免疫反應[17]。在抑制HTR的治療中，Tregs療法已用于臨床試驗，旨在減少或替代可能導致嚴重毒副作用的免疫抑制劑的使用[18]。miRNA是非編碼單鏈小RNA分子，通過抑制mRNA翻譯或促進mRNA降解，在轉錄后調節基因表達。miRNA-146a在免疫細胞的穩態和功能中起著至關重要的調節作用，與常規CD4+T細胞相比，miRNA-146a在CD4+Tregs中高度表達，并控制Tregs的表達和功能[19]。在小鼠同種異位心臟移植模型的HTR中，miRNA-146a與CD4+Tregs的靶基因信號傳導與轉錄激活因子-1(signal transducer and activator of transcription, STAT 1)結合，主要通過STAT1/干擾素(interferon, IFN)-γ信號通路參與調節Tregs細胞。使用miRNA-146a拮抗劑能夠降低miRNA-146a表達，同時協同應用IFN-γ中和抗體可以抑制CD4+T細胞的增殖，減輕排斥過程，延長供體心臟的存活時間[20]。在HTR發生時，Tregs的自噬活性受到損害。自噬是降解細胞內成分的過程，它介導細胞死亡、淋巴細胞穩態和增強Tregs細胞功能。而miRNA-146a下調可以誘導Tregs自噬的發生。miRNA-146a介導的Tregs自噬上調有效延長了同種異體移植物的存活并防止同種異體移植物損傷[21]。以上均表明，已miRNA-146a為代表的miRNAs在抑制心臟移植免疫排斥反應方面具有重要作用。

3 小結

心臟移植后發生的HTR是不可避免的，小鼠心臟移植模型的制作一方面可以模擬HTR的發生，另一方面可以對能夠抑制HTR發生的制劑進行實驗研究。目前能夠抑制HTR的制劑有mTOR免疫抑制劑、阿司匹林、自組裝前藥納米顆粒和miRNA-146a拮抗劑4類，其抑制機制不同，抑制效果不一，但是均有抑制HTR的效果。希望后續可以有更多的制劑或方法為小鼠心臟移植動物模型的建立提供免疫抑制治療新策略，從而提高動物模型建立的成功率。