丁酸鈉對細胞凋亡和實驗動物影響的研究進展*

王浩然 廖 軼 姚 嬌 趙德明 周向梅

(中國農業大學動物醫學院，北京 100193)

丁酸鈉(sodium butyrate；NaB)呈白色、具有腐敗的臭味。與水混溶，易溶于有機溶劑，由于丁酸易揮發的性質，在動物飼料中添加丁酸鈉是最經濟有效的方法[1]。機體可以從腸道菌群作用下發酵膳食纖維來產生丁酸。研究發現給幼齡反芻動物飼喂丁酸鈉可以很好地促進瘤胃乳頭的生長，丁酸還能提供結腸上皮細胞能量，有助于組織的修復和發育[2]。

細胞凋亡是細胞程序性死亡方式之一，細胞凋亡是一種主動的死亡過程，受一系列基因激活、表達和調控的影響，細胞凋亡參與機體內細胞數量的調節，并清除體內無功能、損傷、有害的細胞，在機體的穩態和發育過程中起到重要的作用。細胞凋亡主要由三條通路引起，分別為線粒體通路、內質網通路和死亡受體通路[3]。

丁酸鈉處理的實驗動物模型主要由炎性反應、腫瘤以及營養代謝組成。此類動物模型對不同疾病的機制研究起到了重要的作用[4]。本文梳理了丁酸鈉影響細胞凋亡的具體機制，比較了丁酸鈉在不同實驗動物中的作用，討論了丁酸鈉在不同細胞系以及動物模型中的作用差異，旨在為闡明丁酸鈉在疾病治療中的重要作用。

1 丁酸鈉對細胞凋亡的影響

丁酸鈉作為一種組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制劑，具有調控細胞凋亡的能力。現有的研究證明，丁酸可直接作用于凋亡通路或凋亡相關蛋白起到調節作用。

1.1 丁酸鈉激活死亡受體通路誘導凋亡

丁酸鈉通過增加腫瘤壞死因子相關凋亡配體(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)的表達從而介導凋亡[5]。TRAIL是腫瘤壞死因子(TNF)家族中的成員，TRAIL能和死亡受體(death receptor 4,5, DR4、DR5)相結合誘導包括結腸癌細胞的死亡。丁酸可增強人結腸癌細胞(HT-29和HCT-116)對TRAIL介導的細胞凋亡的靈敏度。丁酸鈉激活許多的轉錄基因都涉及到SP1位點[6]，例如丁酸鈉可以激活重組人半乳糖凝集素1基因(Galectin-1)、線粒體HMGCoA合成酶基因和p21Waf1基因啟動子的Sp1位點。正常情況下HDAC會和DR5基因的轉錄位點SP1結合，當外源添加丁酸鈉時可以阻斷HADC與SP1的結合，SP1激活DR5的表達，DR5和TRAIL結合后活化caspase-8進而激活caspase-3、7誘導凋亡的產生，當然這種情況是DR5獨立發生的與DR4無關[7](圖1)。此外，丁酸鈉處理8個結腸癌細胞系后增強了其中的7個細胞系Fas依賴的凋亡。但丁酸鈉并不增加Fas受體的表達，對于TNF-α和IFN-γ聯合用藥介導的凋亡，丁酸鈉處理后會增強這種凋亡，但并不是調控FADD/Mort1適配子的水平而是增加它的敏感性，因此丁酸鈉作為一種毒性低、可以增強癌癥細胞內Fas傳遞信號的藥物，可能具有治療意義。

1.2 丁酸鈉激活線粒體通路誘導凋亡

丁酸鈉可以通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，這個機制可能與HDAC抑制劑會促進凋亡蛋白的表達或減少抗凋亡蛋白的產生有關[8]。同時各種HDAC抑制劑能刺激活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生，而抗氧化劑治療會降低它們的抗癌活性。雖然ROS產生的最初來源仍不清楚，但氧化應激可能在HDAC抑制劑誘導的腫瘤細胞死亡中發揮重要作用，氧化應激可能激活線粒體通路激活細胞凋亡[9]。

丁酸鈉可通過調節肝細胞中的miRNA-22進而促進細胞凋亡。miRNA-22在肝癌細胞或其他癌細胞中均有下調，miRNA-22的下調對腫瘤的增殖、分化有一定的影響。SIRT1在腫瘤細胞中表達量很高，SIRT1的表達可以調節細胞內的抗氧化劑(SOD)使細胞產生的ROS維持在一個平衡的水平[10]。丁酸鈉處理肝癌細胞后會上調miRNA-22的表達同時靶向抑制SIRT1，SIRT1的抑制會影響抗氧化劑SOD的下調從而產生大量的活性氧(ROS)造成線粒體的損傷，Bcl-2含量下降激活內源性凋亡通路，線粒體釋放細胞色素C引發下游caspase-9的表達最后活化caspase-3從而促進凋亡的產生[11]。

丁酸鈉和派立福辛(perifosine，Per)聯用可誘導白血病細胞凋亡。Per就是烷基溶血磷脂的一種；烷基溶血磷脂是一類新型的抗腫瘤藥物，可靶向細胞膜誘導腫瘤細胞凋亡而不影響正常細胞。Rahmani等人研究發現[12]丁酸鈉和Per聯用可以誘導U937、HL-60和jurkat白血病細胞的線粒體損傷，誘導細胞色素C和凋亡因子的釋放、caspase-3/8的升高，顯著抑制細胞生長，此外Nab和Per聯合處理后還發現促凋亡蛋白Bax從胞質內轉移到線粒體上，同時過表達Bcl-2會延緩Nab+Per所介導的凋亡。這意味著Nab和Per促進U937細胞的凋亡是通過激活線粒體通路而發生的。以上這些現象的機制與信號調節激酶(ERK1/2)通路和AKT通路的失活、JNK的激活、神經酰胺和活性氧(ROS)的增加有關，但JNK的激活并不起主導作用，同時神經酰胺的產生需要ERK1和AKT通路的失活介導。

膠質瘤相關癌基因同源物1(glioma-associated oncogene homolog,GiL1)是Gil家族中具有激活功能的主要轉錄因子，在多種腫瘤細胞中存在著Gil1的過表達，且GiL1的過表達可以顯著促進肺腺癌細胞(A549)的增殖并抑制細胞凋亡。通過體內外試驗發現[13]丁酸鈉和多西他賽可以抑制Gil1的表達并上調BaX 、p21、Cyclin A、cleaved-caspase3表達，同時下調CDK1、CDK2、Bcl-2、Ki-67的表達，進一步抑制下游的細胞凋亡，這種情況在丁酸鈉和多西他賽聯合處理時更加顯著。這提示丁酸鈉單獨用藥抑制癌細胞增殖、并促進凋亡或提高多西他賽藥物的敏感度是治療肺腺癌的潛藏機制之一。雖然試驗結果未能直接證明丁酸鈉激活線粒體通路,但是Bax作為促凋亡的主要蛋白,其機制就是改變線粒體膜通透性釋放細胞色素C，所以丁酸鈉促進肺腺癌細胞凋亡機制可能與線粒體通路有關，這為治療肺腺癌提供了新的思路。

MicroRNA(miRNA)可通過抑制mRNAs的翻譯并降解其活性成為腫瘤治療的潛在靶點，近年來有研究證明miR-139-5p的大量表達會影響腫瘤患者的預后效果，在膀胱癌細胞中的miR-139-5p表達量很低并且靶向調控Bmi-1可以起到抑制腫瘤的作用[14]。Bmi-1是PcG家族中的成員，在腫瘤細胞中高表達，其表達水平與腫瘤的侵襲、發展、預后有關[15]。丁酸鈉處理膀胱癌細胞(T24和5637細胞)后會上調miR-139-5p的表達量，進而抑制下游Bmi-1的表達。Bmi-1的下調一方面可以抑制腫瘤細胞的遷移，另一方面還能造成線粒體膜的損傷產生過量的活性氧(ROS)，上調了caspase-3和PARP(凋亡標志物)的表達，抑制了Bcl-2的活性從而促進凋亡的產生；有趣的是，這種線粒體損傷同時也激活依賴AMPK- mTOR的自噬反應，當把這種自噬抑制后發現凋亡被抑制了；丁酸鈉產生通過破壞線粒體膜產生過多的ROS來誘導凋亡；同時膀胱癌細胞中丁酸鈉誘導的自噬抑制后會影響凋亡，這表明自噬也能調節凋亡[16]。此外丁酸鈉處理神經瘤細胞后可以打開細胞的線粒體通透性的暫態孔隙(MPTP)造成質子泄露，造成線粒體膜電位損傷誘導了凋亡的產生[17]。

1.3 丁酸鈉激活內質網應激誘導凋亡

丁酸鈉可通過激活內質網應激誘導細胞凋亡。內質網廣泛存在于真核細胞當中是合成和加工蛋白質的主要場所，同時也是Ca2+貯存的主要場所，內質網通路介導的凋亡主要是由于內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ER-stress)引起的，當錯誤折疊蛋白和未折疊蛋白過多積累時，細胞激活未折疊蛋白反應(unfold protein reponse，UPR)可以誘導內質網應激下游的反應[18]。雖然丁酸鈉對于調節內質網應激的研究相對較少，但有研究用丁酸鈉處理慢粒白血病細胞株K562和阿霉素耐藥的K562后發現細胞凋亡率顯著上升，進一步研究中發現丁酸鈉處理后的內質網應激相關蛋白BIP顯著增加，這提示NaB誘導的K562細胞凋亡可能與內質網應激有關[19]。

2 影響丁酸鈉誘導細胞凋亡的因素

2.1 細胞系影響丁酸誘導的凋亡

丁酸鈉作用于不同細胞系會產生不同的效果。例如Mandal的研究證明了丁酸鈉處理乳腺癌細胞后會下調Bcl-2的表達從而促進乳腺細胞的凋亡。NaB處理感染牛結核分枝桿菌(M.bovis)的THP-1細胞后發現，Bcl-2的表達下調，從而誘導高水平的凋亡[20]。然而，丁酸鈉處理大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型細胞后可通過激活PI3K/Akt信號通路，減輕MCAO后神經細胞的凋亡[21]。LPS處理過的牛乳腺上皮細胞會誘導高水平的細胞凋亡，但使用NaB處理這類細胞后可以上調PI3K/AKT信號通路，降低caspase-3 等凋亡相關蛋白的表達[22]。前文中所提到的Nab和per聯用處理白血病細胞會上調caspase-8、caspase-3和細胞色素C的表達量，但單獨使用Nab處理細胞后，細胞色素C的含量并沒有變化。這可能由于NaB并非直接影響白血病細胞釋放cytC，而是通過上調促凋亡蛋白Bak和Bid。這可能和之前的試驗結論有所出入，這種現象的原因可能是試驗過程中所用的細胞系不同，例如在做丁酸鈉影響人類肝癌細胞系HCC-T和HCC-M研究時，這種細胞系會產生大量的Bcl-2，可能會影響丁酸鈉處理后的結果，此外腫瘤細胞系和正常細胞系也有較大的差異，總結發現丁酸鈉處理腫瘤細胞系后往往會促進凋亡的產生，但對于丁酸處理一些致病菌感染或機能缺陷的正常細胞系時，細胞凋亡的水平表現出較大差異。

2.2 丁酸鈉濃度影響丁酸鈉誘導的凋亡

Zhang等人[23]的研究中表示丁酸鹽在低劑量(2 mmol/L)時誘導HCT-116細胞自噬，在高劑量(5 mmol/L)時自噬水平相對較低，但高劑量處理過的細胞凋亡相關蛋白上調較大，誘導了高水平的細胞凋亡。使用高劑量的丁酸鈉處理乳腺癌細胞MCF-7后會誘導高水平的凋亡，而中劑量處理時凋亡的產生相對較小[24]。綜上可知，不同濃度的丁酸鈉處理后的細胞可能誘導不同的反應。

即便等濃度丁酸鈉處理細胞后，細胞內的準確濃度也無法判定，這種現象可歸因于，線粒體通過β氧化可以快速的代謝丁酸。因此代謝丁酸速率快的細胞可能不太容易受到其誘導凋亡的影響，這解釋了依賴丁酸為主要能源的結腸細胞不會受到高濃度丁酸的影響。在進行小鼠實驗時往往將丁酸鈉的血漿濃度定在10 mmol/L，雖然有些實驗證明口服給藥可以達到標準的血漿濃度，但都是通過灌胃的方法操作的，某些試驗將丁酸鈉和食物混雜在一起給藥是無效的，因為動物采食過程中可能會忽略丁酸鈉顆粒造成同組動物中丁酸鈉血漿濃度有很大差異，這都會影響最后凋亡的強弱。此外與細胞實驗相比，動物實驗往往需要更高濃度的丁酸鈉,這可能是與首過效應(first pass effect)有關。所有口服藥物的吸收需要通過胃腸壁，然后進入門靜脈，這種反應造成藥物的代謝增強、吸收減少，治療效果下降。

3 丁酸鈉對實驗動物模型的影響

越來越多的研究表明丁酸鈉可以改變實驗動物模型的生理狀態。有研究表明[25]丁酸鈉處理慢加急性肝衰竭的小鼠模型可降低小鼠血清中炎性因子HMGB1、TNF-α、IL-18均顯著下調，進而對小鼠模型起到保護作用。此外丁酸鈉與小檗堿聯合應用可對高脂飲食引起的C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病起到緩解作用。提取自中藥的小檗堿長期以來一直用于腹瀉的治療，近年來，也被用于臨床治療高脂血癥。丁酸鈉和小檗堿聯合應用可激活肝臟AMP依賴的蛋白激酶通路：脂肪合成基因的表達明顯減少,而脂肪分解基因的表達明顯上調,同時出現肝臟炎性因子表達減少。

丁酸鈉在慢性肺部疾病起到一定的積極作用。研究證明[20]丁酸鈉處理牛結核病小鼠模型后可顯著減少小鼠肺臟的炎性灶，增加IL-1β的分泌，進而緩解牛分枝桿菌引起的感染。

丁酸鈉在大鼠心肌缺血性損傷模型中表現出積極影響。有研究發現[26]丁酸鈉降低心肌缺血大鼠梗死面積,對大鼠急性心肌缺血性損傷有保護作用。其具體機制為丁酸鈉能夠上調pkm2的表達,增強其活性,增加ATP的含量。Pkm2在心肌能量代謝和腫瘤的研究方面起到重要的作用，這提示丁酸納對腫瘤動物模型也具有調控作用。也有研究發現丁酸鈉處理黑色素瘤荷瘤的小鼠模型可以通過抑制腫瘤相關巨噬細胞的分化、增殖以及下調促瘤巨噬細胞因子而抑制小鼠腫瘤細胞的增長[27]。綜上所述，丁酸鈉在多種實驗動物模型上起到一定的干預作用，為實驗動物模型的發展提供理論依據。

4 總結和展望

丁酸鈉不僅具有改善腸道菌群穩態、抗感染、抗氧化等生物學功能還是HDACi中的一種。丁酸鈉主要通過影響線粒體、內質網應激以及死亡受體通路來誘導細胞凋亡(圖2)。細胞凋亡在腫瘤等疾病的發生和發展具有重要作用；因此闡明丁酸鈉對細胞凋亡調控機制，對于腫瘤及相關疾病的治療與預防具有重要意義。丁酸鈉還可以通過調節實驗動物機體細胞因子的分泌及相關基因的表達影響疾病的發生和發展。當然丁酸鈉的作用也遠不止于此。未來的研究方向可以探究丁酸鈉作為輔助藥物提升抗腫瘤藥物效果的分子機制，以及構建更多的實驗動物模型，為醫用丁酸鈉提供理論依據。