胚胎發育生物標志物的研究進展

謝聰聰，王雪瑩，安 卓，姚勝杰，馬 婧，王樹松,*

(1.河北省計劃生育科學技術研究院 河北省生殖醫院 國家衛生健康委員會計劃生育與優生重點實驗室河北省生殖醫學重點實驗室，河北 石家莊 050071； 2.河北醫科大學 研究生學院， 河北 石家莊 050017)

自1978年世界首例采用體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)技術的嬰兒誕生以來，相關的輔助生殖技術得到迅速的發展，全球運用輔助生殖技術已經誕生了500 多萬人，但輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)的妊娠率亟需提高。體外受精的最終目的是植入具有最高發育潛能的胚胎，而影響卵子受精、胚胎發育和植入的因素有很多。胚胎質量直接影響體外受精的結局，如何評估胚胎的發育潛能是研究的熱點。目前，對胚胎質量的評估方法主要有形態學、蛋白組學和代謝組學等。代謝組學主要通過對生物新陳代謝過程中代謝產物的變化規律進行研究，揭示生物體生理和病理狀態下生長及發育各個環節的特點。代謝組學在ART方面具有很重要的意義，胚胎代謝物與胚胎發育之間有著密切的關系。將形態學、蛋白質組學和代謝組學結合，有望確定胚胎生長發育的生物標志物，快速、非侵入性的鑒別優質胚胎，提高ART的妊娠率?，F將胚胎發育生物標志物的研究進展進行總結。

1 氨基酸是胚胎發育過程中的關鍵調控參數

整個機體氨基酸的生物利用度和代謝與其他營養物質相互作用，對生殖的生理過程至關重要，包括配子發生、受精、植入、胎盤，胎兒生長和發育。氨基酸是培養基的重要組成部分，用于體外培養受精卵到囊胚階段，培養液中添加氨基酸可增加胚胎體外培養的妊娠率[1]。

氨基酸代謝是卵母細胞發育所必需的。已發現卵母細胞減數分裂缺陷、細胞器功能障礙和表觀遺傳改變與細胞中氨基酸轉運蛋白的降低和糖/脂含量的增加密切相關[2]。雖然胚胎形態相似，但是不同發育階段胚胎氨基酸代謝確有不同，胚胎發育是否阻滯與其氨基酸的代謝利用率有明顯不同。通過分析不同發育階段胚胎的氨基酸代謝情況，第2～3天發育潛能較好的胚胎對谷氨酸、甲硫氨酸、精氨酸攝取量少，分泌丙氨酸和天冬酰胺較少；8細胞到桑椹胚階段對絲氨酸攝取量少，而丙氨酸、甘氨酸釋放量少[3]。整個胚胎發育過程中持續產生丙氨酸，持續攝取亮氨酸。高發育潛能的胚胎處于低氨基酸代謝狀態。胚胎攝取天冬酰胺、甘氨酸和亮氨酸與臨床妊娠和活產顯著相關，胚胎培養液中妊娠組天冬酰胺的量較未妊娠者明顯增加，而甘氨酸和亮氨酸明顯減少，發育潛能較好的胚胎氨基酸代謝明顯低于發育阻滯的胚胎[1]。采用高效液相色譜檢測培養液，結果表明培養液中谷氨酰胺和丙氨酸水平與妊娠結局呈負相關[4]。并且發現培養基中有6種氨基酸(天門冬氨酸、甘氨酸、纈氨酸、天絲氨酸、亮氨酸和賴氨酸)代謝在整倍體和非整倍體胚胎之間存在明顯差異[5]。

因此，氨基酸是胚胎發育過程中關鍵的調控參數，其利用率可作為檢測胚胎發育潛能的合理指標，但是需要大量循證醫學的結果，根據培養液氨基酸濃度指導優質胚胎的篩選。

2 碳水化合物是胚胎發育的主要能量來源

胚胎培養液中碳水化合物主要是葡萄糖和丙酮酸。胚胎發育所需的ATP有兩個主要途徑分別是有氧糖酵解和無氧糖酵解。在胚胎發育的早期階段(致密化前)，丙酮酸和乳酸是其主要能量來源。到了胚胎發育晚期，葡萄糖攝取穩步上升，從桑椹胚到囊胚的過渡期，葡萄糖的利用率顯著增加。葡萄糖可以通過線粒體的作用發揮其早期的有益效應，丙酮酸作為胚胎培養液底物的能源之一，它能夠抑制卵母細胞的老化[6]。

2.1 丙酮酸與胚胎發育

丙酮酸對哺乳動物的發育潛力是必需的。在卵母細胞體外成熟過程中，豬培養基中添加丙酮酸可以提高受精率(metaphase Ⅱ，MⅡ)和囊胚率，進而提高早期胚胎發育潛能[7]。通過對第4天胚胎培養液分析，發現丙酮酸攝取量高的胚胎更容易形成囊胚[1]。植入率高的胚胎對丙酮酸吸收波動是相對較小的。然而2～8細胞的胚胎，丙酮酸的吸收與胚胎活力和妊娠呈負相關[1]。

2.2 葡萄糖與胚胎發育

糖是胚胎培養液中主要的能源物質，在胚胎發育過程中糖主要以糖酵解途徑、己糖胺生物合成途徑和磷酸戊糖途徑等發揮作用。因此，通過檢測胚胎培養液中糖的吸收和代謝可以作為預測胚胎發育潛能的重要標記。對葡萄糖攝取高的囊胚發育潛能更高，優質胚胎對葡萄糖攝取量多[8]。妊娠組胚胎對培養液中葡萄糖的攝取顯著高于未妊娠組[9]。葡萄糖與囊胚發育有著緊密聯系，可以作為囊胚發育的一個生物標志物。

胚胎對葡萄糖及丙酮酸的攝取與妊娠結局的關系受到多因素的影響，如：研究對象的不同、周期特征、刺激方案、胚胎培養條件、儀器設備等。因此，把葡萄糖和丙酮酸作為胚胎發育生物標志物的實驗研究需要進一步完善。

3 細胞因子是胚胎發育和植入潛能的標志

細胞因子是指由免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激而合成并分泌的一類生物活性分子，它們介導細胞之間的信息交換與相互調節，參與免疫應答、免疫調節和炎性反應過程。可溶性人白細胞抗原因子-G(soluble human leukocyte antigen G，sHLA-G)、β-人絨毛促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-hCG)、血小板活性因子(platelet activating factor，PAF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、轉化生長因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)、瘦素(leptin)等內源性“調節因子”可以作為胚胎發育和植入潛力的指標[10]。胚胎和子宮內膜分泌的細胞因子調控植入過程，在植入期間專注于母胎對話，現在對生物標志物的關注越來越多，因為它們可能在植入和妊娠過程中具有很好的預后特性。

3.1 sHLA-G與胚胎發育和植入潛能

白細胞抗原-G(human leukocyte antigen G，HLA-G)是一種具有限制性表達模式的非經典HLA-Ⅰ類分子，HLA-G主要由母胎界面外滋養細胞分泌的主要組織相容性復合分子，sHLA-G是HLA-G的蛋白產物，可結合NK 細胞抑制受體，保護胎兒免受母體免疫系統的殺傷，對維持正常的妊娠過程起著重要的作用。sHLA-G 在早期的胚胎培養液中存在表達，并且與胚胎的早期發育和種植密切相關[11]。大部分妊娠患者組HLA-G的濃度顯著高于非妊娠組，針對卵胞漿內單精子注射(intracyto-plasmic sperm injection,ICSI)患者移植sHLA-G呈陽性的胚胎妊娠率和種植率顯著高于移植sHLA-G 陰性組，因此sHLA-G 可以作為評價胚胎質量和獲得更好臨床結局的指標[10]。59.73 IU/mL sHLA-G是區分妊娠和持續妊娠患者與未妊娠或流產患者的最敏感和特異的閾值[12]。sHLA-G具有明確定義范圍和標準單位可提供一種非侵入性方法來鑒定最適合移植的胚胎，可用作胚胎篩選的標志物。

3.2 β-hCG與胚胎發育和植入潛能

β-hCG在胚胎培養液中的定量被認為是滋養外胚層分化和囊胚活力的一個有力指標[10]。利用培養液中β-hCG水平來評價胚胎質量是輔助生殖領域研究的熱點。胚胎培養液中總β-hCG水平能夠區分形態相似的同級別胚胎哪個更適合移植。β-hCG在早期胚胎發育的各個階段幾乎均有表達，胚胎分泌β-hCG含量與胚胎種植潛能顯著相關，并且單囊胚分泌β-hCG含量可預測囊胚質量，優質囊胚的β-hCG分泌量顯著高于非優質囊胚和發育阻滯的胚胎[13]。

3.3 PAF與胚胎發育和植入潛能

PAF是一種脂質介質，具有多效生物學特性的信號磷脂。PAF在調控生殖生理各個方面起著重要作用，外源PAF與起始形成肌醇三磷酸和二酰基甘油的細胞表面受體結合，影響細胞內鈣的水平，進而影響胚胎發育。人類、小鼠、綿羊、兔、豬等多個物種在植入前胚胎分泌PAF，在擴張囊胚的培養液中可檢測PAF的含量。胚胎分泌的PAF在胚胎代謝，生長和發育過程中具有重要作用，外源性添加PAF可刺激胚胎代謝和分裂，提高胚胎生長和發育，胚胎分泌PAF含量增加，相應的妊娠率也會增加[14]。因此，PAF可以作為篩選胚胎和預測妊娠結局的標志物。

3.4 IGFs與胚胎發育

IGFs是一種具有多功能細胞增殖調控的多肽物質， IGF-1和IGF-2是目前發現胰島素樣生長因子家族中僅有的成員。胚胎分泌的IGF-1可刺激對葡萄糖的攝取，并且對胚胎細胞增殖和分化起著重要調控作用。多囊卵巢綜合征患者卵泡液中高水平IGF-1其獲卵數、卵裂數、優質胚胎數、臨床妊娠率高于低IGF-1水平組[15]。在胚胎培養液中補充IGF-1可能會通過脂質代謝、卵母細胞功能和線粒體功能相關基因的差異表達而影響胚胎的能力[16]。IGF-2對胚胎的發育速度起著調控作用。胚胎培養液中IGF-2的濃度隨著胚胎的生長而增加，并且在桑椹胚到囊胚轉化時濃度較高，可很好地檢測到，在人胚胎培養液中添加IGF-2后滋養層細胞凋亡率降低[17]。IGFs對胚胎的發育具有一定的作用，但是否是胚胎植入前的重要因素需要進一步驗證。

3.5 其他生物標志與胚胎發育和植入潛能

EGF和TGF-α具有相似的氨基酸序列，且均與EGF受體結合，屬于表皮生長因子家族的成員。EGF受體可能參與胚胎早期發育和著床過程，在胚胎發育過程中可能發揮特定作用，胚胎的特定生長因子以自分泌或旁分泌方式參與著床前胚胎發育和囊胚的形成[18]。在牛胚胎的培養基中同時添加了牛血清白蛋白和EGF，提高了囊胚的孵化能力和囊胚的細胞總數，提高了滋養層細胞的入侵能力[19]。Leptin是一種16 ku的小型營養肽，在人囊胚培養液中可檢測到大量的leptin，囊胚分泌的leptin顯著高于早卵裂的胚胎，leptin通過調控卵丘激活因子來調節卵母細胞的發育能力，促進囊胚的多能性[20]。白介素-6(interleukin-6，IL-6)添加到人的胚胎培養液中顯著促進了胚胎的發育，增加了 IL-6濃度與胚胎質量的相關性可能與囊胚形成時間有關，D6組囊胚胚胎液中IL-6濃度顯著高于D5組[21]。通過對單個微滴培養液中IL-6分析，結果表明妊娠囊胚組對IL-6的攝取增加，IL-6在囊胚發育和植入中具有潛在作用。在胚胎培養液中添加IL-1β顯著增加囊胚質量[22]。

細胞因子相互作用網絡復雜，基于單個細胞因子的檢測評估胚胎質量相對困難，聯合檢測多因子，甚至是聯合形態學特征、發育動力學特征等綜合評估是十分必要的。目前，實現單個胚胎培養液中多個細胞因子的共同檢測具有一定的前景。

4 蛋白質組學相關的胚胎發育生物標志物

隨著蛋白質組學技術的發展，對人類胚胎分泌物的研究越來越深入。在人類胚胎分泌物的初期研究，主要進行單個蛋白質或分子的靶向分析。時間質譜發現在第3天胚胎的分泌物中檢測到蛋白，觀察到蛋白質表達譜與胚胎發育明顯相關，第一個成功分析人類胚胎分泌蛋白質的表達譜，并提出通過對胚胎分泌物的分析可提供非侵入性的胚胎評估方法[23]。非整倍體和整倍體胚胎分泌的蛋白等代謝產物之間具有明顯差異，載脂蛋白1(lipocalin-1)確定為非侵入性非整倍體篩選的潛在生物標志物。非整倍體囊胚的lipocalin-1的分泌增加可以代表胚胎本身的受損狀態，反映了非整倍體囊胚的情況[24]。

由于受研究過程的限制，如蛋白質濃度低、儀器設備檢出限低等，目前對植入前胚胎分泌蛋白質的認識有限。但胚胎發育的蛋白質組學分析對胚胎發育選擇是一種比較好的方法，具有很好的發展前景。

5 問題與展望

本文總結了近些年與胚胎質量有關的物質，都有可能成為篩選胚胎的生物標志物。由于胚胎發育是一個復雜的過程，包括卵子受精、胚胎分裂、增殖、植入等多個因素，如何運用無創的方法精準篩選出最具發育潛能的胚胎是研究的難點和熱點，目前還沒有明確篩選胚胎的唯一標準，但可以通過胚胎發育的生物標志物篩選優質胚胎和發育潛能高的胚胎。根據胚胎的不同發育階段，在每一階段選擇合適準確的標志物，這是未來輔助生殖技術的研究方向和熱點。在新技術的基礎上，進一步研究標志物對胚胎發育的機制，使標志物評價胚胎發育成為普遍可行的方法。