垂體腺瘤免疫微環境及免疫治療的研究進展

郭曉鵬，幸 兵，馬文斌

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 神經外科，北京 100730)

垂體腺瘤(pituitary adenomas,PAs)是第二位常見的原發性中樞神經系統(central nervous system, CNS)腫瘤，約占所有原發性CNS腫瘤的17%[1]。垂體腺瘤通過對鞍區周圍神經及血管組織產生占位壓迫效應及分泌過量激素而對人體造成危害。絕大多數垂體腺瘤為良性，通過手術、藥物治療及放療可將其治愈，但仍有約10%的垂體腺瘤表現有極高的侵襲性，且傳統治療方式對其無效，被稱為難治性垂體腺瘤[2]。免疫微環境對腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移等過程有重要的調控作用。免疫治療可打破腫瘤生長的溫床，目前已成為難治性腫瘤及惡性腫瘤的第四大治療方案， 對黑色素瘤等表現出了較好的治療效果。近年來，針對垂體腺瘤免疫微環境及免疫治療的研究開始興起，垂體腺瘤微環境中免疫細胞、免疫分子及細胞因子的促腫瘤及抗腫瘤作用逐漸被認識，為尋找免疫治療靶點提供了重要依據。

1 垂體腺瘤(PAs)的免疫細胞浸潤

垂體腺瘤微環境中除腫瘤細胞外，還有多種免疫細胞浸潤，主要包括淋巴細胞(T細胞、B細胞)、巨噬細胞、中性粒細胞、自然殺傷(natural killer, NK)細胞等[3]。大多數免疫浸潤細胞可發揮抗腫瘤免疫功能(如CD8+T細胞、M1型巨噬細胞、NK細胞等)，但也有部分免疫細胞可促進腫瘤的侵襲及生長(如CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞、M2型巨噬細胞等)[4-5]。抗腫瘤免疫細胞及促腫瘤免疫細胞共同影響著垂體腺瘤細胞的增殖及侵襲，不同垂體腺瘤組織中的免疫細胞組成存在顯著的異質性。以下介紹垂體腺瘤微環境中主要的免疫細胞。

1.1 T細胞

T細胞是垂體腺瘤微環境中最常見的免疫細胞類型[3]。根據表面免疫分子表達及免疫功能不同可將T細胞分為多種亞型，包括細胞殺傷性CD8+T細胞、輔助性CD4+Th1細胞、輔助性CD4+Th2細胞、調節性CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞等；其中，前兩種細胞有較強的腫瘤殺傷效能，后兩種細胞可抑制抗腫瘤免疫。

相比于正常垂體組織，垂體腺瘤中T細胞浸潤數量增加，且CD4/CD8及FoxP3/CD8比例升高；絕大多數垂體腺瘤中可檢測出T細胞浸潤[3, 6-7]。CD8+T細胞是垂體腺瘤中最重要的免疫殺傷細胞，而Treg細胞是重要的“免疫剎車”細胞。快速生長型垂體腺瘤(高Ki-67)及侵襲性腺瘤微環境中CD8+T細胞浸潤比例明顯下降，而CD4+T細胞及Treg細胞浸潤比例明顯升高[4, 8]。功能型垂體腺瘤中CD4+T細胞比例較無功能型腺瘤升高[9]。關于垂體生長激素(growth hormone, GH)型腺瘤的研究顯示，CD8+T細胞的浸潤比例與腫瘤向海綿竇侵襲及生長抑素類似物耐藥呈負相關，侵襲性及耐藥的GH腺瘤中CD8+T細胞含量較少[10]。T細胞相關的抑制性免疫微環境(CD8low CD4high FoxP3high，或低CD8/CD4及低CD8/FoxP3)可促進垂體腺瘤細胞增殖及侵襲性生長[2, 4]。

1.2 巨噬細胞

巨噬細胞是垂體腺瘤中最常見的非特異性免疫細胞。巨噬細胞可吞噬非自身抗原或將其呈遞給細胞殺傷性T細胞或NK/NKT細胞，從而發揮免疫殺傷或抗原呈遞作用。腫瘤微環境中的巨噬細胞可由血液中單核細胞遷移分化形成或來自于垂體組織局部的固有巨噬細胞。巨噬細胞根據免疫分子表達及免疫功能不同，分為抗腫瘤免疫為主的M1型巨噬細胞(CD163-)及促腫瘤免疫為主的M2型巨噬細胞(CD163+)。

正常垂體組織中的巨噬細胞主要分布在毛細血管周圍，其中超過半數為M2亞型[4]。垂體腺瘤中巨噬細胞數量約為正常垂體組織中的3～4倍，且M2/M1比例升高約3倍[8, 11]。稀疏顆粒型垂體GH型腺瘤及零細胞腺瘤中巨噬細胞數量明顯多于致密顆粒型GH型腺瘤及促腎上腺皮質激素(adrenocortico-trophic hormone, ACTH)型腺瘤，且巨噬細胞數量與垂體腺瘤的大小及海綿竇侵襲相關[11-12]。基于臨床標本的流式細胞學分析及體外實驗結果顯示，M2型巨噬細胞作為促腫瘤免疫細胞，其浸潤比例與垂體腺瘤侵襲性、腫瘤大小及增殖活性(Ki-67)呈正相關[8, 11, 13-14]。

1.3 中性粒細胞

中性粒細胞的腫瘤免疫作用具有兩面性：在多數腫瘤中發揮免疫殺傷作用，但在部分腫瘤中也可具有促腫瘤作用，包括促進新生血管生成、誘導免疫抑制及協助腫瘤細胞遠端轉移等[4]。腫瘤微環境中的中性粒細胞根據免疫功能不同分為不同的亞群，如N1/N2 中性粒細胞、腫瘤相關性中性粒細胞及多形核中性粒細胞等，但并沒有明確的免疫分子對中性粒細胞亞群進行有效識別[15]。垂體腺瘤微環境內的中性粒細胞數量遠低于正常垂體組織，垂體GH型腺瘤內的中性粒細胞比例低于無功能型腺瘤[8]。

1.4 其他免疫細胞

腫瘤微環境中的B細胞多聚集在腫瘤邊緣，高增殖性垂體腺瘤微環境中可見大量B細胞浸潤，同時也可伴有大量巨噬細胞、CD4+T細胞及Treg細胞浸潤[8]。

自然殺傷細胞(natural killer cell, NK cell)細胞可通過細胞表面受體與腫瘤細胞直接結合，發揮接觸式細胞殺傷功能，NK細胞數量增加通常與良好的預后相關；腫瘤細胞也可將反應型NK細胞誘導為無反應型NK細胞，從而抑制抗腫瘤免疫反應[4]。垂體泌乳素型腺瘤患者外周血中NK細胞數量低于健康人群及溴隱亭治療后的泌乳素型腺瘤患者[4]。

2 垂體腺瘤(PAs)中免疫分子表達

免疫細胞間及免疫細胞與腫瘤細胞間免疫分子的相互作用直接影響腫瘤微環境中免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷行為。垂體腺瘤免疫微環境中發揮重要作用的免疫分子主要包括程序性死亡受體1(programmed cell death 1, PD-1)、程序性死亡受體配體1(programmed death ligand 1, PD-L1)、C-X-C趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor 4, CXCR4)及C-X-C趨化因子配體12(C-X-C chemokine ligand 12, CXCL12)等。

2.1 PD-1/PD-L1

T細胞表達PD-1分子，腫瘤細胞及抗原提呈細胞表達PD-L1分子，PD-1/PD-L1結合后可通過促進細胞殺傷性T細胞凋亡并抑制Treg細胞凋亡發揮免疫抑制作用，從而避免過于嚴重的自身免疫損傷，同時也成為了腫瘤細胞免疫逃逸的重要機制之一[2, 16]。

功能型垂體腺瘤中PD-L1分子表達量明顯高于無功能型垂體腺瘤，初發垂體腺瘤中PD-L1分子表達高于復發腺瘤[6, 9, 16]。垂體GH型腺瘤中PD-L1分子表達量與腫瘤細胞的增殖活性及血GH激素水平正相關[2, 7]。拮抗鼠ACTH腺瘤細胞的PD-L1分子表達可顯著減小垂體腺瘤體積并降低血ACTH水平[16]。

2.2 CXCR4/CXCL12

CXCR4分子主要表達在垂體GH細胞、泌乳素細胞及ACTH細胞，而CXCL12主要表達在垂體ACTH細胞[4]。垂體腺瘤中CXCR4及CXCL12分子表達量明顯高于正常垂體。CXCR4可促進腫瘤細胞增殖；拮抗CXCR4分子可促進GH3大鼠垂體腺瘤細胞凋亡并抑制其增殖。侵襲性垂體腺瘤中CXCR4/CXCL12分子表達量高于非侵襲性腺瘤；CXCL12可促進垂體腺瘤中新生血管生成，高水平CXCL12與組織低氧代謝相關[17]。

3 垂體腺瘤(PAs)中細胞因子分泌

免疫細胞及腫瘤細胞可分泌一系列細胞因子，調節形成抗腫瘤或促腫瘤的免疫微環境或對已有微環境造成影響[5]。白細胞介素(interleukin, IL)及趨化因子配體(chemokine ligand, CCL)是垂體腺瘤微環境中的重要細胞因子。

3.1 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17

IL-1在人垂體腺瘤、鼠AtT-20 垂體腺瘤細胞系及大鼠GH3 垂體腺瘤細胞系有表達，可促進GH和促甲狀腺激素分泌，抑制泌乳素釋放，但其與腫瘤細胞增殖的相關性存在爭議[4]。IL-2在人ACTH腺瘤、鼠AtT-20細胞系及大鼠GH3細胞系中有表達，可促進GH及ACTH分泌及泌乳素釋放，并促進人及大鼠GH細胞增殖[4, 18]。IL-6在人垂體腺瘤各亞型中均有表達，可促進GH分泌及泌乳素釋放，且與腫瘤侵襲性生長相關[19]；IL-6可促進大鼠GH3細胞增殖及DNA合成[18]。垂體GH腺瘤細胞可持續大量分泌IL-8及IL-6；生長抑素治療可抑制IL-8及IL-6分泌，而IL-1β可促進IL-8及IL-6分泌。IL-8水平與巨噬細胞及中性粒細胞浸潤呈負相關，其可促進垂體腺瘤細胞侵襲性生長并降低對傳統治療的反應[8]。侵襲性垂體腺瘤中高表達IL-17，且IL-17表達量與腫瘤侵襲性成正比，IL-17水平高的垂體腺瘤難以達到全切。

3.2 CCL

CCL2-CCL4是垂體腺瘤中的主要趨化因子[8]。CCL2-CCL4由垂體腺瘤細胞分泌，無功能型腺瘤分泌量明顯高于GH型腺瘤，但以上趨化因子水平與腫瘤細胞的增殖活性及侵襲性無明顯相關性[4]。CCL2-CCL4可趨化巨噬細胞及中性粒細胞進入腫瘤微環境中，巨噬細胞及中性粒細胞比例較高的垂體腺瘤中CCL2-CCL4水平也較高[8, 14]。CCR5水平在芳基烴受體相互作用蛋白(aryl hydrocarbon receptor interacting protein, AIP)基因突變的垂體腺瘤中與正常垂體組織無差異，而在AIP野生型垂體腺瘤中顯著升高；CCL5也可趨化巨噬細胞進入腫瘤微環境[11]。

3.3 其他細胞因子

γ干擾素(interferon gamma, IFN-γ)可抑制垂體腺瘤細胞的分泌及增殖；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)水平在侵襲性垂體腺瘤，尤其是侵襲骨質的垂體腺瘤中明顯升高[19]，其也可通過上調血管內皮生長因子表達促進腺瘤內出血[4]；轉化生長因子(transforming growth factor beta, TGF-β)可抑制泌乳素腺瘤細胞增殖及分泌泌乳素，抑制GH細胞增殖[4]。

4 垂體腺瘤(PAs)免疫治療的動物模型研究

垂體腺瘤動物模型的建立為免疫治療機制的探索提供了可能。在LAF1雜交鼠皮下及顱內可應用ATT/D16v.2細胞系成功建立垂體腺瘤模型，該模型高表達免疫抑制性分子PD-L1，其表達量僅次于黑色素瘤，并遠高于膠質瘤、肺癌及乳腺癌模型[16]。針對該模型的抗PD-L1治療可顯著減小垂體腺瘤體積、降低血ACTH水平、延長雜交鼠生存期。國內也有學者應用Wistar大鼠腹腔注射乙烯雌酚建立垂體泌乳素型腺瘤模型、應用F344鼠口服雌酮建立垂體腺瘤模型、應用摘除雙側卵巢后的Wistar大鼠腹腔注射雌激素建立垂體泌乳素型腺瘤模型等成功案例。

5 人垂體腺瘤(PAs)免疫治療的臨床研究

對于難治性垂體腺瘤及垂體癌，目前仍無有效的治療方法[2, 20]。近年來，對腫瘤免疫微環境的研究識別出了多種潛在有效的治療靶點；其中，PD-1和CTLA-4是腫瘤免疫治療的常用靶點分子[2, 5]。在垂體腺瘤免疫治療領域有兩項針對PD-1及CTLA-4分子的臨床試驗正在進行中(NCT04042753及NCT02834013)，均處于招募患者階段。文獻中已有3例對垂體腺瘤患者進行免疫治療的個案報道。第一例報道為難治性垂體ACTH腺瘤伴肝轉移的患者，在接受了4次手術、兩次放療及替莫唑胺+卡培他濱化療后，腫瘤仍進展；應用抗PD-1及抗CTLA-4聯合治療后，垂體腺瘤縮小59%、肝轉移灶縮小92%、ACTH水平由45 550 pg/mL 降至66 pg/mL[21]。第二例為復發性垂體ACTH腺瘤患者，腫瘤經過抗PD-1治療后并未縮小[22]。第三例患者為垂體ACTH腺癌，應用抗PD-1及抗CTLA-4聯合治療后腫瘤穩定[23]。基于轉錄組數據的研究表明，垂體腺瘤微環境中PD-1及CTLA-4分子的表達量不高但異質性較高[3]；因此，以上3例免疫治療個案的成功與否具有較大偶然性。全面識別垂體腺瘤的免疫微環境對篩選免疫治療靶點至關重要，且最終的免疫治療效果有待臨床試驗證實。

6 問題與展望

6.1 垂體腺瘤(PAs)免疫微環境認識不足

目前針對垂體腺瘤免疫微環境中細胞分布的研究較少，且免疫細胞識別多依賴于單個蛋白標志物的免疫組化染色結果，如識別巨噬細胞僅應用CD68陽性作為標準，此類識別方式可能會高估或錯誤估計某類細胞的比例[11-13, 24]；基于單細胞多個蛋白標記的高通量質譜流式分析技術或單細胞測序技術可對免疫細胞進行準確識別。

同一分子可表達在不同細胞上，如B7-H3可表達在巨噬細胞、腫瘤細胞及NK細胞表面，從而發揮不同的生物學作用，既往免疫組化結果僅可識別某分子表達的總體比例，而無法分辨分子所附著的細胞類型；而質譜流式或單細胞測序技術可了解某種免疫分子在每類細胞的表達比例，從而提供更為精確的基于細胞的分子靶點。

既往文獻僅關注了熱門免疫細胞及分子，其他潛在有效的“非感興趣”免疫治療靶點可能被忽略，如B7-H3分子等[25]；質譜流式或單細胞測序技術可實現對免疫微環境的全面探索，通過與臨床特征進行匹配，識別出所有可能與腫瘤侵襲、生長、進展相關的免疫微環境特征，并為后續應用細胞及動物實驗進行驗證提供重要基礎。

6.2 垂體腺瘤(PAs)免疫治療的臨床前研究及臨床研究不足

臨床前的實驗研究是臨床研究的基礎，也是臨床研究得以成功實施及高效進行的重要保障。與惡性膠質瘤相比，關于垂體腺瘤免疫治療的細胞及動物實驗研究不足[16, 24]，限制了其向臨床研究的轉化進度。目前垂體腺瘤領域內在研的兩項臨床試驗應用抗PD-1聯合抗CTLA-4對垂體腺瘤進行治療。然而，根據現有的臨床前結果，PD-1及CTLA-4分子在垂體腺瘤中的表達水平整體不高而異質性高[3]，可能限制后續臨床試驗的結果。根據臨床前研究結果得出潛在有效治療靶點，對接受免疫治療的患者按分子表達狀態進行分組，之后進行針對性的分組研究可更加高效地利用現有資源，達到事半功倍的效果。

6.3 展望

免疫細胞、腫瘤細胞、免疫分子及細胞因子間復雜的相互作用形成了不同的腫瘤免疫微環境，使垂體腺瘤表現出不同的臨床生物學行為。針對微環境中特定免疫細胞或分子的免疫治療可能成為垂體腺瘤除手術、藥物及放療之外的有效治療方案。應用基于單細胞的高通量質譜流式技術或單細胞測序技術對免疫微環境特征進行全面而精確的識別，是垂體腺瘤免疫治療成功的關鍵。

關于垂體腺瘤免疫微環境及免疫治療的研究仍處于初期階段，應繼續增加對該領域的研究。應充分認識到侵襲性及難治性垂體腺瘤患者基數較大，但針對以上腫瘤免疫微環境及免疫治療的研究較為缺乏，限制了該類垂體腺瘤的治療。通過逐步加深對垂體腺瘤免疫微環境的認識，之后通過臨床前實驗及后續臨床試驗進行免疫治療探索及驗證，有望改善侵襲性及難治性垂體腺瘤患者的預后。