缺血性腦梗死后免疫機制的研究進展

桂雨農，姜 超，徐中菊

腦卒中是世界范圍內威脅人類健康并造成重大經濟負擔的主要病因，分為缺血性腦梗死和出血性腦梗死，其中缺血性腦梗死占多數[1]。近年來，溶栓已成為治療缺血性腦梗死的基本方法，由于嚴格的時間窗限制，該治療方法不能使所有病人受益[2]。因此，需要尋找一條治療缺血性腦梗死的有效策略，現從缺血性腦梗死免疫機制出發，結合相關文獻資料探索治療缺血性腦梗死及改善預后的新思路。

1 缺血性腦梗死后引發炎癥反應的機制

腦血管阻塞或狹窄引起局部血流不足使得血管壁剪切應力發生改變，氧供不足及活性氧生成共同刺激內皮細胞和白細胞，激活血小板及凝血級聯反應，從而快速啟動凝血系統，引起微血管阻塞，局部持續缺氧引起一氧化氮生成增多。隨著生物利用度降低，使血小板進一步黏附聚集和血管收縮逐漸形成缺血阻塞相互促進的惡性循環，激活的內皮細胞合成分泌內皮素-1、前列環素及多種細胞因子等應激物質，進而高表達E-選擇素、P-選擇素和細胞間黏附分子1(ICAM-1)，激活的白細胞表達高活性整聯蛋白，二者共同介導中性粒細胞和單核細胞等，與內皮黏附、驅動并向梗死部位遷移[3]。在穩態條件下，較少有激活的白細胞穿過血腦屏障，但血腦屏障通透性受到生理和病理波動的影響[4]。急性腦血管損傷后，激活的白細胞產生炎性細胞因子、活性氧、血小板激活因子、蛋白水解酶和白三烯類等，進一步加劇血管收縮和血小板聚集，伴隨內皮細胞間緊密連接的嚴重受損使得血腦屏障通透性增加，這個逐漸惡化的過程最終導致內皮細胞從基底膜脫落，水和自由基進入病人大腦導致出血轉化[4-5]。內皮細胞活化導致內皮細胞上血管細胞黏附分子1(VCAM-1)等黏附分子表達，進一步增加白細胞聚集，聚合酶δ-相互作用蛋白2(Poldip2)是內皮屏障功能和炎癥反應的關鍵調節因子，通過相關機制促進腦血管炎癥和白細胞聚集[6]。上述變化使腦實質發生局部腦細胞三磷酸腺苷(ATP)供給不足、炎癥反應啟動、酸中毒、離子穩態失衡、生物能學衰竭、興奮性毒性物質釋放和線粒體功能紊亂等一系列關聯事件，導致神經元受損或死亡，從而形成局灶缺血，同時，這些神經元釋放損傷相關分子模式(damage-related molecular patterns，DAMPs)激活了免疫細胞表面模式識別受體并產生了促炎因子，導致腦缺血早期炎癥環境形成[3]。DAMPs可改變血腦屏障滲透性、白細胞浸潤、組織水腫和腦損傷，血腦屏障破壞和之后發生的白細胞外滲加劇了缺血性損傷，DAMPs增強了白細胞外滲，從而在腦缺血區域產生不利影響，因此抑制DAMPs和白細胞浸潤是一種有前景的治療缺血性腦梗死的思路。Poldip2作為內皮功能障礙和白細胞聚集的重要介質，可能成為降低缺血性腦梗死發病率的靶點。相關研究從機制方面證實了黏附斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)通路激活是Poldip2介導VCAM-1誘導的一個關鍵媒介[6]。因此，今后研究應進一步確定Poldip2如何調節FAK通路及抑制Poldip2能否在廣泛腦部病變中發揮治療作用。

2 缺血性腦梗死后中樞神經系統的免疫反應

缺血性腦梗死引起受損腦組織免疫過度激活，不僅是一種內在的器官反應，也是中樞神經系統的固有免疫反應和外周免疫細胞之間相互作用的復雜結果。腦缺血發生后，中樞神經系統抗原與全身免疫接觸，導致自身免疫反應激活[7]。炎癥小體是一種分子蛋白復合物，作為天然免疫系統的重要組成部分，可將細胞偏離穩態的情況感知為危險信號，之后引發炎癥反應。炎癥小體中的細胞質內模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)包括核苷酸寡聚化結構域(NOD)樣受體熱蛋白結構域相關蛋白1(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 1，NLRP1)、NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)、NOD樣受體家族蛋白4(the NOD-like receptor family CARD domain containing protein 4，NLRC4)或黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)，這些成分可識別炎癥介質和DAMPs等。有研究表明，早期NLRP3通過減輕炎癥和穩定血腦屏障，保護缺血再灌注損傷，該團隊將NLRP3神經元上調確定為缺血再灌注前24 h內早期事件，對應人類腦卒中的超急性期和急性期[8]。故阻斷NLRP3可能成為一個新靶點，以限制血管閉塞和再通后再灌注期間炎癥驅動的梗死發展。

考慮到腦卒中發生時機體免疫細胞數量有限，中樞神經系統和外周免疫系統在兩個區域之間適當分配有限的免疫細胞池，通過向大腦提供足夠數量的免疫細胞，維持外周免疫，從而產生必要的腦卒中后炎癥反應[9]。外周免疫細胞浸潤可能是克服腦缺血損傷的必要反應，在受傷的大腦中引起的神經炎癥不可避免地干擾周圍免疫[9]。明確中樞神經系統和外周免疫在對抗缺血性損傷的協同作用，可進一步了解缺血性腦梗死的免疫機制。

3 缺血性腦梗死后外周免疫細胞應答

免疫系統受到機體嚴格調控，過度或不足的激活可能導致過度炎癥或感染發生。健康人免疫系統是平衡的，病理狀態下，機體免疫系統失衡。缺血性腦梗死發生后免疫反應與受損大腦的炎癥反應密切相關，但神經炎癥與外周免疫紊亂的相關性尚未明確。

有研究顯示，受損的血腦屏障是外周血白細胞侵入腦組織的主要通道，缺血后血腦屏障發生實質改變，隨著趨化因子分泌，促使中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞等白細胞連續進入缺血組織，其中，中性粒細胞是首先侵入缺血組織的血源性免疫細胞，其次是單核細胞，白細胞增多是腦卒中后炎癥反應的標志物[10]。中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)、淋巴細胞與單核細胞比值(LMR)可能是急性缺血性腦梗死的預后標志物。

3.1 中性粒細胞 中性粒細胞是首個被吸引到缺血腦組織的血源性免疫細胞，可生成活性氧、蛋白酶、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9和促炎性趨化因子等，在缺血性腦梗死中血腦屏障破壞、血栓形成和促炎反應發揮著關鍵作用。中性粒細胞極化與功能異質性有關：通過細胞外刺激，中性粒細胞從神經毒性N1表型向神經保護性N2表型的轉變[9]?，F階段觀察到的中性粒細胞功能異質性和細胞表型表明，中性粒細胞極化可能成為治療缺血性腦梗死的一種思路。

3.2 單核細胞與自然殺傷細胞 單核細胞在缺血性腦梗死發生后從血液中移動到炎癥組織，這一過程是對傷口愈合和組織修復的重要免疫應答，在局部炎癥環境中單核細胞對緩解缺血性腦梗死的臨床癥狀至關重要，蛋白質組學促進了與單核細胞相關的新型生物標志物發展，是評估缺血性腦梗死預后的單核細胞[11]。有研究顯示，高水平趨化因子C-C-基元受體2與低水平CX3C基序趨化因子受體1組成的單核細胞亞群(CCR2HighCX3CR1Low)在缺血性腦梗死后不久滲透，之后受特異性細胞因子影響，過度表達CX3CR1，將其轉化為高水平CX3C基序趨化因子受體1與低水平趨化因子C-C-基元受體2組成的巨噬細胞亞群(CCR2LowCX3CR1High)，從而衰減缺血性腦梗死的損害[12]。受傷腦組織中CCR2HighCX3CR1Low單核細胞轉化可能是抗炎反應的一部分，有助于在缺血性腦梗死后維持微環境穩態，針對單核細胞轉化調節可能為腦梗死治療領域提供一條新思路。

自然殺傷細胞是一種細胞毒性淋巴細胞，在先天免疫中發揮作用。在未啟動或處于激活前情況下，自然殺傷細胞可對病理性損傷快速反應，有研究表明，自然殺傷細胞通過增強細胞毒性和炎癥加劇腦梗死，提示自然殺傷細胞釋放的γ干擾素(IFN-γ)通過招募巨噬細胞或樹突狀細胞導致缺血損傷[9]。

3.3 T淋巴細胞 缺血性腦梗死是一個多階段過程，缺血性腦損傷后由于免疫細胞流入腦組織。T淋巴細胞作為重要的免疫細胞，在缺血性腦梗死發病機制中發揮著關鍵作用，缺血性腦梗死后表現為總T淋巴細胞數量下降，1周內T淋巴細胞數量減少，1～2周，大腦中雙陰性T細胞(double-negative T cell，DNT)和CD4+及CD8+T細胞數量逐漸增加，2周后細胞數量逐漸恢復，各亞群比例失調，即CD4+T細胞數量下降，CD8+T細胞數量增加[13-14]。有研究發現，CD8+T細胞最早出現在腦梗死后3 h，而CD4+T細胞最早出現在腦梗死后24 h，其中CD8+T細胞可能與神經元死亡有關，CD4+T細胞可能在組織修復中發揮著作用[15]。CD4+T細胞表面PD-1與Tim-3陽性率可能成為判斷急性腦梗死病人預后的臨床指標[16]。

腦卒中早期，觀察到小鼠腦中DNT數量增加，同時CD200-CD200R1信號通路在急性缺血性腦梗死發展過程受到干擾，CD200R1高表達促進抗炎細胞因子釋放，以緩解缺血性損傷；慢性期，白細胞介素(IL)-10+Foxp3+調節性T淋巴細胞從第2周開始增加，腦CD3+CD4+Foxp3+Treg細胞數量在腦卒中后6個月增加，胸腺中CD4+Foxp3+調節性T淋巴細胞(Treg)細胞和腦中IL-10+Foxp3+Treg細胞慢性期逐漸增加，這些表型和數量改變與神經系統嚴重程度評分(Neurological Severity Score，NSS)相關[13，17]。CD137L-CD137軸通過產生促炎細胞因子促進炎癥，有研究通過CD137L-CD137軸對局灶性缺血性腦梗死小鼠模型中炎癥組織相關的腦損傷和神經系統缺陷的潛在影響，首次提供了證據，即CD137L-CD137軸通過激活缺血性腦梗死后的炎性信號通路，促進腦損傷和神經功能缺陷，表明CD137L-CD137軸的藥理學靶向干預可能有利于限制腦損傷和腦缺血后神經功能缺陷[18]。T淋巴細胞數量恢復和IL-10+Foxp3+Treg增加可能對神經功能長期預后有影響，且急性期和慢性期T淋巴細胞動態變化可能在發病和恢復中發揮著不同的作用。為探討T淋巴細胞的動態變化，Minha Ki團隊[13]分析第1天至第6個月淋巴器官和大腦中T淋巴細胞，結果顯示，CD4+CD62L-效應T淋巴細胞在血液中比例升高，脾臟中比例降低，進一步觀察到tMCAO小鼠大腦中效應T淋巴細胞水平增加。表明腦卒中早期，效應性T淋巴細胞從脾臟流出，通過血液進入大腦損傷部位，幼稚的T細胞可能留在脾臟。

T淋巴細胞在腦卒中后腦損傷部位有不同的浸潤時間，取決于促炎或抗炎功能。相關研究表明，活化的T淋巴細胞在缺血性腦梗死早期發揮著有害的作用，Tregs作為具有潛在神經保護作用的內源性調節劑，在血腦屏障滲透性、白細胞浸潤、組織水腫和腦損傷中發揮著保護作用，并對預后康復起重要作用[13，15，19]。區別于T淋巴細胞，B淋巴細胞在腦卒中的作用已被闡明，缺乏成熟B淋巴細胞的小鼠中觀察到較大的缺血損傷和較高的死亡率，通過移植B淋巴細胞可改善小鼠預后，表明B淋巴細胞在腦卒中的有益作用[9]。腦卒中后T淋巴細胞長期變化尚未明確，深入研究T淋巴細胞在缺血性腦梗死不同時期的動態變化可能有助于明確潛在的治療靶點。

3.4 LMR與NLR 中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞與腦梗死的嚴重程度及預后恢復有關，但聯合多個炎癥標志物LMR和NLR的研究尚未明確。有研究回顧性分析339例急性缺血性腦梗死病人的臨床資料，結果顯示，急性缺血性腦梗死病人腦缺血損傷后，淋巴細胞計數減少，單核細胞計數增加，該變化可能與腦梗死后免疫抑制相關，而LMR與病人短期預后有關，較高的LMR常提示較好的臨床結局[20]。除LMR外，NLR>3.5可有效預測腦梗死不利結局[21]。將中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞整合成LMR、NLR等新指標，不僅可較好地反映腦梗死后免疫狀態，同時也是一項預測急性缺血性腦梗死嚴重程度、預后恢復的指標。

4 腸道菌群的免疫機制

腸道菌群與較多的腦梗死危險因素直接相關，包括高血壓、糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化、血管功能障礙等[22]。急性腦缺血同時可誘發局部神經炎癥反應，改變外周免疫穩態，導致腸道菌群結構改變。大面積腦缺血病灶導致腸道菌群失調，腦梗死后小鼠腸道菌群多樣性減少，擬桿菌過度生長表明腦梗死后菌群失調[23]。從免疫機制角度分析，腸道微生物群和代謝物可能影響腦梗死恢復，有研究顯示，缺血性腦梗死導致腸道失調使得腸道上皮完整性受損，周圍皮質神經炎癥，從而引起結腸炎癥反應、腸道屏障受損、內毒素血癥增加及局灶性炎癥激活[24]。腸道微生物群和代謝物可直接調節來自腸道的免疫細胞，之后遷移到缺血腦組織并參與神經損傷和修復過程，同時在調節腸道屏障滲透性方面發揮著關鍵作用，進一步通過影響微生物群或外周循環中的代謝物引發免疫應答，腸道菌群可改變膠質細胞在中樞神經系統中反應，可能具有神經元修復調節功能[25]。隨著腸道微生物菌群和腦梗死相關性研究領域的進一步深入，可能從免疫機制角度切入缺血性腦梗死后腸道疾病的治療。

5 免疫機制在治療缺血性腦梗死的應用

雖然靜脈溶栓和血管內介入治療已證實是有效的治療缺血性腦梗死的方法，由于嚴格的治療適應證和時間窗限制，僅有少數病人有條件接受溶栓治療。治療腦卒中核心癥狀，尤其是腦卒中后急性腦損傷方法有限，故有必要尋找一條新思路應用于大量臨床病人。

阿托伐他汀是一種在缺血性腦梗死治療中具有抗炎作用的藥物，而腸道微生物群在缺血性腦梗死發病機制中發揮著重要的作用。有研究顯示，阿托伐他汀通過抑制永久性大腦中動脈閉塞(pMCAO)小鼠梗死周圍皮質小膠質細胞促炎極化，顯著改善感覺運動行為缺陷，并減輕了小膠質細胞介導的神經炎癥[24]。阿托伐他汀逆轉了微生物組成，如增加厚壁菌和乳酸菌豐度，降低擬桿菌豐度，從而提高了糞便丁酸水平，促進了腸道屏障功能，同時，阿托伐他汀可調節腸道免疫功能，如單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotac ticprotein-1，MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、循環內毒素(脂多糖結合蛋白)降低，IL-10升高。從阿托伐他汀治療的小鼠中收集的糞便微生物群，通過移植可有效減輕pMCAO小鼠神經炎癥，且糞便微生物群移植的抗炎作用與口服阿托伐他汀相似[24]。上述研究結果提示，阿托伐他汀通過微生物組成和腸道屏障功能發揮抗炎作用，可改善神經行為缺陷，減小梗死體積，抑制小膠質細胞促炎極化，同時調節腸道微生物，抑制結腸促炎細胞因子產生，增加腸道緊密連接蛋白表達。通過介導腸道菌群恢復，改善腸道屏障功能，調節腸道免疫功能，共同參與腦梗死小鼠抗炎過程。

牡荊苷作為一種從牡荊葉和牡荊子中提取的黃酮類化合物，對急性腦缺血大鼠具有抗氧化應激活性和腦保護作用。相關研究表明，牡荊苷可改善急性腦缺血大鼠神經行為學，減小腦梗死體積，降低缺血性神經元細胞凋亡率，且劑量越高作用越佳，推測與減少到達大腦紋狀皮質組織神經型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)免疫陽性神經元數量、抑制免疫表達、下調mRNA和蛋白表達有關[26]。為缺血性腦梗死病人的研究提供了治療新方向。

丁苯酞臨床可治療輕中度急性缺血性腦梗死，具有抗神經細胞凋亡作用，但其對炎癥反應影響的研究機制尚未明確。有研究觀察丁苯酞對缺血性腦梗死大鼠腦組織的影響證實其對缺血性腦梗死有保護作用，結果顯示，作用機制與抑制腦組織核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(nuclear factor-kappa B，NF-κB)p65活化，腦組織炎性因子IL-6、TNF-α水平降低有關[27]。

免疫反應是一種高度調節的防御系統，免疫檢查點作為一條配體-受體相互作用觸發的刺激或抑制信號通路，可調節組織和病原體特異性反應，在癌癥、感染和自身免疫疾病中發揮著關鍵作用[4]。腦血管疾病的神經炎癥與不良神經功能有關，免疫失活檢查點調節劑可能是治療腦血管疾病急性、慢性神經炎的策略，可減少免疫細胞聚集、細胞因子分泌及腦水腫和神經退行性變。抑制性檢查點如細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)、程序性細胞死亡蛋白-1(PD-1)和淋巴細胞活化基因-3(LAG-3)是維持自身耐受并限制免疫反應持續時間和強度的負性調節因子；OX40(CD134)和401BB等陽性調節因子具有協同刺激功能，其他檢查點，如T細胞免疫球蛋白和黏蛋白域-3(Tim-3)具有刺激和抑制調節功能[4]。因此，根據不同免疫細胞群中的表達和影響模式及炎癥級聯過程中的活動時間，每個檢查點可能具有獨特的調控特征，基于檢查點的免疫治療具有巨大的臨床潛力。

有研究表明，急性腦梗死病人血清IL-6水平升高，且病人發病6 h內腦脊液IL-6水平與24 h腦梗死體積呈正相關，提示IL-6參與損傷早期的急性炎癥反應，缺血性腦損傷后應用IL-6中和抗體可顯著減小腦梗死體積，減輕急性期腦組織炎性反應，抑制急性炎性細胞對腦組織的浸潤，從而改善腦梗死發生后28 d神經功能，提示IL-6中和抗體處理可能成為治療腦缺血損傷的有效方法[28]。缺血性腦梗死發生后，神經血管單元(neurovascular unit，NVU)炎癥和外周血白細胞浸潤是導致腦損傷擴大的主要因素。全腦和局灶性腦缺血模型中，應用最廣泛的CDKs抑制劑(R)-活性氧covitine及其(S)異構體均可減少腦損傷。S-活性氧covitine通過調節缺血時NVU反應發揮作用，一些炎癥模型中，活性氧covitine可減輕白細胞介導的炎癥反應，主要靶向抑制cdk1、cdk2、cdk5、cdk7和cdk9的特異性，表明這些CDKs在缺血性腦梗死后NVU細胞和白細胞的炎癥過程中發揮著關鍵作用[29]。有研究顯示，R/S-活性氧covitine在幾種缺血性腦卒中模型中顯示出有益的作用：(S)-活性氧covitine可減輕腦水腫和減小梗死體積，與減少神經元死亡、保護血腦屏障和內皮、促進小膠質細胞增殖和星形膠質細胞反應性有關。有研究表明，(R)-活性氧covitine可作用于其他NVU細胞及非缺血狀態時的白細胞[29]。上述研究提供了(S)-活性氧covitine和特異性CDKs抑制劑作為缺血性腦梗死潛在治療藥物的可能性。

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)作為中樞神經系統的一種內源性配體，具有抗凋亡、免疫調節、促進神經發生和血管生成等多種重要功能。G-CSF治療通過減少促凋亡蛋白，增加抗凋亡蛋白，發揮對受損神經元的神經保護作用，既減少了急性神經元變性，同時增加了腦缺血后的長期可塑性[15]。有研究顯示，CB2受體激動劑可治療缺血性腦梗死，而CD16+單核細胞中CB2受體表達升高與缺血性腦梗死病人腦梗死嚴重程度相關，可能作為缺血性腦梗死的潛在藥理學靶點[30]。

缺血性腦梗死破壞了大腦免疫系統靜止狀態的平衡。炎癥在擴大缺血性中樞神經系統神經元損傷中發揮著重要的作用，雖然抗炎策略可減輕神經炎癥，同時應考慮其對周圍免疫的影響。調節外周免疫的其他策略包括遠程缺血條件反射，通過改變免疫細胞組成可實現器官之間的交叉耐受及腦卒中后干細胞治療等[9]。預防性抗生素和益生菌治療可能是免疫調節的新策略，可減輕周圍感染和調節腸道微生物群，最終影響腦卒中病理生理過程[5]。若結合溶栓術，免疫調節可最大限度減輕缺血性損傷和免疫缺陷，從而防止全身感染，提高缺血性腦梗死后生存率和長期預后，今后需開展大規模、設計合理、方法規范的臨床試驗。

6 小結與展望

綜上所述，免疫反應和炎癥是缺血性腦梗死病程中的關鍵因素，免疫系統是一把“雙刃劍”，雖然在某些環節對缺血腦組織發揮著保護作用，并提供了一些治療新選擇，同時引起一些嚴重的副作用，因此，分析缺血性腦梗死和免疫機制之間的關系是必要的。充分了解炎癥反應在缺血性腦梗死中的具體作用和機制可能為探索新療法提供選擇。進一步確保促炎因子和抗炎因子之間的動態平衡，有助于較好地預測發病后一些非血管并發癥，其中重要的并發癥是腦卒中后感染，腦卒中后感染導致病人死亡率增加及預后不良[7]。缺血性腦梗死免疫學發病機制的深入分析有助于病人獲得較好的臨床結局和康復效果。有研究通過探討嚙齒動物研究腦卒中后炎癥反應，對人類和嚙齒動物缺血后神經炎癥進行系統分析和比較，結果顯示，嚙齒動物腦卒中模型炎癥反應與腦卒中病人相似[31]。腸道菌群微生物領域中，需深入研究特定的微生物群在腦卒中和免疫反應中的相互作用，以區分和明確缺血性腦梗死中的神經保護或有害細菌種類，腸道微生物菌群可能是解決腦梗死及改善預后的重要靶點。

將中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞整合成的LMR、NLR等新指標，不僅可較好地反映缺血性腦梗死后的免疫狀態，同時可作為預測急性缺血性腦梗死嚴重程度、預后恢復的相對簡便、經濟的指標。針對多種傳統治療缺血性腦梗死藥物的研究提示，免疫反應在疾病發生發展和藥物起效過程中發揮著重要的作用，今后需進行大規模臨床研究探討具體作用機制，進一步探討缺血性腦梗死后免疫機制，有望發掘出新的治療方法。