補中益氣湯含藥血清調控GSK-3β介導的Wnt/β-catenin信號通路增強A549細胞對順鉑敏感性的研究①

王 瑩 付權澤 牟琪瑞 劉春英 王 淳 高 原（遼寧中醫藥大學，沈陽 110847）

肺癌是全球高發的惡性腫瘤，嚴重影響人類健康，肺腺癌是其較常見的類型［1］。順鉑是肺腺癌一線化療藥物，屬于細胞周期非特異性藥物，可使腫瘤細胞周期停止，但治療同時可降低機體免疫功能，并出現多器官毒性損傷［2-3］。順鉑治療肺癌過程中常因耐藥、轉移和不良反應降低患者生活質量，影響治療效果，是臨床治療難題［4-5］。因此，如何增效減毒是當前順鉑治療肺癌急需解決的問題。補中益氣湯是中醫“培土生金法”經典方劑，可抑制肺癌生長，與順鉑聯合能強化臨床療效，且利于降低不良反應，提高患者生存質量，作用機制值得深入研究［6-8］。課題組前期研究發現，補中益氣湯聯合順鉑抗肺癌作用優于單獨用藥，作用機制與抑制PI3K/AKT信號轉導通路有關［9-10］。但PI3K/AKT信號通路是一個龐大的信號網絡，具體通過其下游哪些通路增強順鉑抗肺癌作用尚未明確。

GSK-3β是PI3K/AKT信號轉導通路的下游靶蛋白，也是參與Wnt/β-catenin信號轉導通路的關鍵作用因子［11-12］。Wnt/β-catenin信號轉導通路是PI3K/AKT下游最為活躍的細胞途徑之一，在腫瘤細胞增殖、侵襲和凋亡中發揮重要作用［13-14］。研究報道，激活Wnt/β-catenin信號轉導通路導致其下游靶蛋白survivin表達上調所引起的細胞凋亡抑制可能使肺腺癌對順鉑的敏感性降低［15］。

課題組前期實驗雖發現補中益氣湯增強順鉑抗肺癌作用與抑制PI3K/AKT信號轉導通路有關，但是否與其下游GSK-3β介導的Wnt/β-catenin信號轉導通路有關尚未見報道。因此，本研究通過補中益氣湯含藥血清聯合順鉑干預A549細胞，檢測GSK-3β介導的Wnt/β-catenin信號通路關鍵信號分子，進一步探討補中益氣湯增強順鉑抗肺癌作用的分子機制，以期為臨床尋求補中益氣湯聯合順鉑治療肺癌的有效靶點及相關中藥新藥開發提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株及動物 SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量190～230 g，由遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（遼）2018-0010。A549細胞株購自中國醫科院腫瘤研究中心細胞庫。

1.1.2 主 要 試 劑 GSK-3β、β-catenin、survivin、β-actin一抗、全蛋白提取試劑盒、核蛋白和漿蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發光液、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購自沈陽萬類生物科技有限公司（批號：WL01456、WL0961a、

WL01684、WL0002、WLA019、WLA004、WLA020、WLA003、WLA001c）；p-GSK-3βser9一抗、RIPA裂解液、羊抗兔IgG-HRP均購自碧云天生物科技有限公司（批號：AG753、P0013B、A0208）；p-GSK-3βtyr216一抗購自英國Abcam生物公司（批號：ab75745）；順鉑購自大連美侖生物技術有限公司（批號：MB1055）；全部藥材均購自遼寧中醫藥大學附屬醫院藥房，并通過遼寧中醫藥大學藥理實驗室鑒定。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 根據新世紀版《方劑學》規定用藥量并結合臨床常用劑量，補中益氣湯組方及劑量為黃芪18 g、甘草9 g、人參6 g、當歸3 g、橘皮6 g、升麻6 g、柴胡6 g、白術9 g，按“人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算小鼠等效劑量，根據預試驗結果篩選最佳中藥濃度，最終選取成人推薦日用量作為本次實驗中藥干預濃度（生藥2.91 g/kg），過濾、水浴蒸發至含生藥終濃度為每毫升含生藥1 g，冷卻，4℃保存備用。SD大鼠每天灌胃給藥（1.314 g/ml，2 ml）1次，連續7 d，末次給藥1 h后，腹主動脈采血置于無菌管，37℃水浴靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，重復離心2次，56℃水浴滅活30 min，0.22μm濾器濾過除菌，-20℃凍存備用。

1.2.2 細胞培養及分組 取對數生長期A549細胞，棄培養液，加入0.25%胰酶1 ml消化2～5 min（肉眼觀察瓶壁半透明細胞層出現細針孔空隙，或倒置顯微鏡下細胞變鈍圓，細胞間隙增大），即可終止消化，加入含20%胎牛血清的RPMI1640培養液5 ml，無菌吸管輕輕吹打使之均勻懸浮，分裝入2個培養瓶，傳代繼續培養，隨機分為4組：a組（對照血清組，10%正常血清處理）、b組（順鉑組，20μg/ml順鉑與10%正常血清共同處理）、c組（補中益氣湯組，10%補中益氣湯含藥血清處理）、d組（補中益氣湯含藥血清聯合順鉑組，20μg/ml順鉑與10%補中益氣湯含藥血清共同處理），每組作用48 h后收集細胞，用于后續實驗。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 各組細胞309 g離心5 min，收集，吸除上清，PBS洗滌2次，309 g離心5 min，收集細胞，吸除上清，殘留約50μl PBS，每管細胞樣品加入500μl Binding Buffer輕輕重懸細胞，加入5μl Annexin V-FITC混勻，加入5μl PI混勻，室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測。

1.2.4 細胞核漿蛋白分離 各組細胞胰酶消化，收集于1.5 ml離心管，1 000 g離心5 min，棄上清，加入CERⅠ（CERⅠ∶PMSF=100∶1），將預冷的CERⅡ加入1.5 ml離心管，4℃、16 000 g離心5 min，上清即為胞漿蛋白提取物。向裝有不能溶解沉淀物（含細胞核蛋白）的原離心管加入預冷NER，4℃、16 000 g離心10 min，上清即為細胞核蛋白提取物。整個細胞核漿分離過程均在冰上操作。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達 收集細胞，以RIPA緩沖液（1×PBS、1%NP40、0.1%SDS、0.1 mmol/L PMSF）于冰上裂解30 min，BCA試劑盒測定蛋白濃度，常規制備蛋白電泳樣品，SDS-PAGE凝膠電泳，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗（p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β、β-catenin、survivin，稀釋濃度均為1∶500）4℃孵育過夜，二抗（羊抗兔IgG-HRP，稀釋濃度1∶5 000）室溫孵育2 h，暗室發光，圖像掃描并分析結果。以所測蛋白條帶與內參條帶光密度比值表示蛋白表達。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件處理數據，計量資料用±s表示，各組數據符合正態分布，采用單因素方差分析，方差齊性時，兩兩比較采用SNK檢驗；不符合參數檢驗者，采用多組劑量資料秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 補中益氣湯含藥血清聯合順鉑對A549細胞凋亡的影響 與對照血清相比，單獨順鉑、補中益氣湯含藥血清聯合順鉑均能顯著提高A549/順鉑細胞晚期凋亡率（P＜0.05），單獨補中益氣湯含藥血清并未顯著提高晚期凋亡率（P＞0.05）。與單獨順鉑相比，補中益氣湯含藥血清聯合順鉑提高晚期凋亡率效果更為顯著（P＜0.05，圖1、表1）。

表1 補中益氣湯含藥血清聯合順鉑對A549細胞凋亡率的影響（±s）Tab.1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing serum combined with cisplatin on apoptosis rate of A549 cells（±s）

表1 補中益氣湯含藥血清聯合順鉑對A549細胞凋亡率的影響（±s）Tab.1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing serum combined with cisplatin on apoptosis rate of A549 cells（±s）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d Late apoptosis rate（%）4.57±0.13 18.29±1.421）6.54±0.752）29.59±1.241）2）

圖1 補中益氣湯含藥血清聯合順鉑對A549細胞凋亡率的影響Fig.1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction containing serum combined with cisplatin on apoptosis rate of A549 cells

2.2 補中益氣湯含藥血清聯合順鉑對A549細胞GSK-3β在細胞漿、細胞核中活性表達的影響 順鉑可顯著下調胞漿p-GSK-3βser9表達（P＜0.05），而補中益氣湯含藥血清聯合順鉑可進一步下調胞漿p-GSK-3βser9表達（P＜0.05），但補中益氣湯含藥血清對胞漿p-GSK-3βser9表達無顯著影響（P＞0.05）；順鉑、補中益氣湯含藥血清、補中益氣湯含藥血清聯合順鉑對A549細胞胞漿GSK-3β、p-GSK-3βtyr216表達均無顯著影響（P＞0.05，表2、圖2A）。順鉑可顯著下調胞核p-GSK-3βser9表達（P＜0.05），而補中益氣湯含藥血清聯合順鉑可進一步下調胞核p-GSK-3βser9表達（P＜0.05），但補中益氣湯含藥血清對胞核p-GSK-3βser9表達無顯著影響（P＞0.05）；順鉑、補中益氣湯含藥血清、補中益氣湯含藥血清聯合順鉑對A549細胞的細胞核GSK-3β、p-GSK-3βtyr216表達均無顯著影響（P＞0.05，表3、圖2B）。

表2 A549細 胞 漿p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表達（±s，n=3）Tab.2 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in cytoplasm of A549 cells（±s，n=3）

表2 A549細 胞 漿p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表達（±s，n=3）Tab.2 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in cytoplasm of A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d p-GSK-3βser9 1.00 0.38±0.091）0.88±0.072）0.20±0.051）2）p-GSK-3βtyr216 1.00 0.92±0.01 0.87±0.05 0.85±0.06 GSK-3β 1.00 0.98±0.04 0.99±0.01 1.10±0.07

圖2 A549細 胞 漿、細 胞 核p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表達Fig.2 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in cytoplasm and nucleus of A549 cells

表3 A549細 胞 核p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表達（±s，n=3）Tab.3 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in nucleusof A549 cells（±s，n=3）

表3 A549細 胞 核p-GSK-3βser9、p-GSK-3βtyr216、GSK-3β蛋白表達（±s，n=3）Tab.3 Expressions of p-GSK-3βser9，p-GSK-3βtyr216 and GSK-3βprotein in nucleusof A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d p-GSK-3βser9 1.00 0.56±0.091）0.88±0.072）0.40±0.051）2）p-GSK-3βtyr216 1.00 0.99±0.04 1.07±0.02 0.92±0.03 GSK-3β 1.00 0.98±0.06 1.01±0.03 0.94±0.02

2.3 補中益氣湯含藥血清聯合順鉑對A549細胞β-catenin、survivin蛋白表達的影響 與對照組相比，順鉑可顯著下調A549細胞β-catenin、survivin蛋白表達（P＜0.05），補中益氣湯含藥血清未使A549細胞β-catenin、survivin蛋白表達發生顯著變化（P＞0.05）；而補中益氣湯含藥血清聯合順鉑可使A549細 胞β-catenin、survivin蛋白表達顯著下調（P＜0.05），同時也較順鉑單獨處理的β-catenin、survivin蛋白表達顯著下調（P＜0.05，表4、圖3）。

表4 A549細胞β-catenin、survivin蛋白表達（±s，n=3）Tab.4 Expressions ofβ-catenin and survivin protein in A549 cells（±s，n=3）

表4 A549細胞β-catenin、survivin蛋白表達（±s，n=3）Tab.4 Expressions ofβ-catenin and survivin protein in A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with a group，1）P＜0.05；compared with b group，2）P＜0.05.

Groups a b c d β-catenin 1.00 0.76±0.051）1.07±0.062）0.42±0.031）2）survivin 1.00 0.47±0.131）1.18±0.052）0.25±0.101）2）

圖3 A549細胞β-catenin、survivin蛋白表達Fig.3 Expressions ofβ-catenin and survivin proteins in A549 cells

3 討論

中醫學認為癌癥是正氣虛弱、邪氣過盛所致，加之化療藥物的毒副反應，使患者正氣更加虛弱，無力對抗邪氣。根據五行規律，土屬脾，金屬肺，脾為肺之母，脾散精以充肺，即“培土生金”。脾轉輸津液，散精于肺，不僅是肺通調水道的前提，也為肺生理活動提供營養。肺脾二臟在病理上相互影響，脾氣虛損時，常導致肺氣不足，邪氣入侵，引發肺病。因此，中醫治療肺癌常用“培土生金”法，通過補益正氣，抵抗邪氣，從而抵御腫瘤。如李東垣所創的補中益氣湯作為“培土生金”法的經典方劑，臨床常用于晚期肺癌治療，能提高機體免疫功能，增加化療藥物敏感性，改善患者生存狀況［7-8］。但中醫治療肺癌的研究中，尚未見“培土生金”法通過調控GSK-3β介導的Wnt/β-catenin途徑增強肺癌對順鉑敏感性的報道。

目前認為GSK-3β是PI3K/AKT信號通路的效應靶蛋白，p-AKT可引起GSK-3βser9磷酸化［16-17］。GSK-3β是一種普遍存在在于細胞內的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是公認的Wnt/β-catenin信號通路信號分子［18-19］。GSK-3β活性受兩個磷酸化位點的控制，GSK-3βser9磷酸化可抑制GSK-3β活性，GSK-3βtyr216磷酸化提高GSK-3β活性［20-21］。本研究發現，順鉑可下調A549細胞胞漿p-GSK-3βser9表達，補中益氣湯含藥血清聯合順鉑可進一步下調p-GSK-3βser9表達，從而增加胞漿中GSK-3β表達，增強肺腺癌細胞對順鉑的敏感性。

正常情況下Wnt/β-catenin信號通路未被激活，細胞漿中β-catenin會被GSK-3β磷酸化，進而啟動泛素化被降解，維持細胞漿中較低水平的β-catenin［22］。而病理情況下，p-GSK-3βser9表達升高，抑制GSK-3β活性，從而使β-catenin在腫瘤細胞內積蓄［23-24］。當細胞漿中β-catenin大量積蓄，β-catenin轉移至細胞核與TCF/LEF家族轉錄因子結合，從而啟動下游靶基因，如survivin等［25］。本研究顯示，順鉑可下調A549細胞β-catenin、survivin蛋白表達，補中益氣湯含藥血清聯合順鉑可進一步下調A549細胞β-catenin、survivin蛋白表達，說明補中益氣湯有助于順鉑抑制Wnt/β-catenin信號通路激活。

survivin是Wnt/β-catenin信號通路下游靶蛋白之一，同時是一種抗凋亡蛋白，生理情況下，細胞內較低水平s urvivin會導致細胞凋亡［26-27］。但當大量β-catenin在細胞內積蓄并轉移至細胞核激活s urvivin蛋白時，使細胞凋亡受抑制，進而導致藥效降低［28］。本研究證實單獨順鉑和補中益氣湯含藥血清聯合順鉑均能顯著提高肺腺癌細胞晚期凋亡率，且后者促進凋亡效果優于前者，說明補中益氣湯可增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性。

綜上，補中益氣湯含藥血清聯合順鉑可抑制p-GSK-3βser9表達，從而增強GSK-3β活性，進一步影響Wnt/β-catenin信號通路，下調β-catenin、survivin蛋白表達，促進肺腺癌細胞凋亡，增強順鉑敏感性。本研究深入揭示了補中益氣湯聯合順鉑抗肺癌作用優于單獨用藥的分子機制，為臨床尋求補中益氣湯聯合順鉑治療肺癌的有效靶點及相關中藥新藥開發提供新的依據，有助于臨床制定合理的肺癌治療方案，提高患者生存率和改善患者生存狀態。此外，研究結果部分揭示了中醫“培土生金”的本質，并為臨床拓展中藥協同順鉑治療肺癌的病機與治法理論提供新的思路。