千金藤素通過PI3K-AKT信號(hào)通路抑制前列腺癌細(xì)胞DU145增殖、侵襲和遷移①

梁澤旭 楊萬(wàn)山 董秀哲（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，延吉 133000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全世界男性第二常見癌癥，致死率排名第六，由于我國(guó)人口增長(zhǎng)和老齡化，PCa發(fā)病率呈逐年上升狀態(tài)［1］。早期PCa多通過手術(shù)治療，而晚期或轉(zhuǎn)移性PCa多采用雄激素剝奪療法（androgen deprivation therapy,ADT）［2］。盡管ADT在最初治療中有較好效果，但大部分患者會(huì)在3年內(nèi)發(fā)展為去勢(shì)抵抗型前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC）［3］。而CRPC患者死亡的唯一因素就是轉(zhuǎn)移［4］。因此，抑制PCa生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移在臨床治療上至關(guān)重要。千金藤素（cepharanthine，CEP）是一種從千金藤中提取的天然生物堿，因其在抗腫瘤及抗炎方面的藥理作用被廣泛關(guān)注［5］。如PAYON等［6］發(fā)現(xiàn)CEP可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖；而KUDO等［7］發(fā)現(xiàn)CEP可通過抑制NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用。盡管CEP已被證明在多種癌癥中起抗癌作用，但其對(duì)PCa細(xì)胞增殖和侵襲遷移的影響尚不清楚。本研究擬探尋CEP是否通過調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路影響PCa細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 材料 CEP購(gòu)自索萊寶公司；E-cadherin（ab40772）、Vimentin（ab92547）和Snail（ab216347）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；PI3K（SRP0691）、p-PI3K（SAB4301553）、AKT（SAB4500797）、p-AKT（SAB43 01497）、GAPDH（SAB2108668）及 二 抗（A9044、A0545）購(gòu)自Sigma公司；740Y-P購(gòu)自Selleck公司；電泳儀、電泳槽、Western blot轉(zhuǎn)膜儀和Gel Doc凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞存活率及藥物濃度檢測(cè) 采用CCK-8檢測(cè)不同濃度CEP（0、5、10、20μmol/L）對(duì)DU145細(xì)胞存活率的影響，按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將CEP處理后的DU145細(xì)胞接種于有蓋玻片的6孔板，細(xì)胞80%融合時(shí)開始實(shí)驗(yàn)，加入一抗（1∶50）、二抗（1∶150）分別孵育2 h，DAPI封片，共聚焦顯微鏡拍照。

1.2.3 Western blot 細(xì)胞經(jīng)CEP和或740Y-P處理后，收集并裂解，取30μg蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育后曝光成像，以GAPDH為內(nèi)參，抗體稀釋比例為E-cadherin（1∶1 500）、Vimentin（1∶1 500）、

Snail（1∶2 000）、PI3K（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、GAPDH

（1∶1 000）、二抗（1∶10 000）。

1.2.4 侵襲和遷移實(shí)驗(yàn) 將CEP處理的細(xì)胞和未處理細(xì)胞分為3組，分別加入帶小室的24孔板，培養(yǎng)24 h后取出小室，甲醛固定，蘇木素染色，封片，顯微鏡下拍照。小室外層鋪基質(zhì)膠后進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，步驟同上。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組同遷移實(shí)驗(yàn)，制備密度為5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液置于24孔板，待細(xì)胞貼壁后給予CEP處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上清，改用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h，20μl滅菌槍頭做“一”字形劃痕，PBS清洗，無(wú)血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，0 h、48 h取樣拍照。

1.2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 通過PharmMapper平臺(tái)（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper）對(duì)CEP的3D化學(xué)結(jié)構(gòu)式進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)后的靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)平臺(tái)（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行KEGG通路富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CEP對(duì)DU145細(xì)胞增殖的影響 不同濃度CEP（0、5、10、20μmol/L，DMSO稀釋）分別處理DU145細(xì)胞24 h，CCK-8測(cè)定生存率，與對(duì)照組相比，CEP≥10μmol/L時(shí)，DU145細(xì)胞增殖被抑制（P＜0.05），5μmol/L時(shí)對(duì)DU145細(xì)胞存活率無(wú)明顯抑制作用（圖1）。

圖1 不同濃度CEP對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of different concentrations of CEP on cell viability

2.2 CEP對(duì)DU145細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的影響 Western blot結(jié)果顯示，DU145細(xì)胞經(jīng)10、20μmol/L CEP處理后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)EMT標(biāo)志物Vimentin和Snail蛋白表達(dá)明顯下降，而E-cadherin蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，圖2A）。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，Vimentin熒光強(qiáng)度隨著藥物濃度增加而減弱，E-cadherin熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.05，圖2B）。

圖2 CEP對(duì)DU145細(xì)胞EMT的影響Fig.2 Effect of CEPon EMT of DU145 cells

2.3 CEP對(duì)DU145細(xì)胞侵襲遷移的影響 侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CEP對(duì)DU145細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，藥物處理組細(xì)胞侵襲和遷移能力呈劑量依賴性減弱（P＜0.05，圖3A）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與侵襲遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，細(xì)胞橫向遷移指數(shù)呈劑量依賴性下降（P＜0.05，圖3B）。

圖3 CEP對(duì)DU145細(xì)胞侵襲遷移及橫向遷移的影響Fig.3 Effect of CEP on invasion and migration of DU145 cells and wound healing

2.4 CEP對(duì)DU145細(xì)胞PI3K-AKT信號(hào)通路的影響 PharmMapper平臺(tái)預(yù)測(cè)CEP潛在靶點(diǎn)共224個(gè)，對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析共得到125個(gè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CEP不僅可對(duì)PCa產(chǎn)生影響，同時(shí)還有29個(gè)靶點(diǎn)作用于PI3K-AKT信號(hào)通路（表1）。Western blot結(jié)果顯示，10、20μmol/L CEP處理DU145細(xì)胞24 h，胞內(nèi)p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）且二者呈劑量依賴性（圖4A）。采用PBS將740Y-P（PI3K-AKT信號(hào)通路激活劑）稀釋至50μg/ml后聯(lián)合CEP（10μmol/L）處理DU145細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)740Y-P能夠逆轉(zhuǎn)CEP對(duì)EMT相關(guān)蛋白的影響（P＜0.05，圖4B）。

圖4 CEP對(duì)DU145細(xì)胞PI3K-AKT信號(hào)通路的影響Fig.4 Effect of CEP on PI3K-AKT signal pathway in DU145 cells

表1 CEP的KEGG通路富集分析Tab.1 KEGG pathway enrichment analysis of CEP

3 討論

PCa發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居第一，已成為男性健康的主要威脅［8-10］。當(dāng)PCa進(jìn)展為浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性疾病時(shí)，患者五年生存率急劇下降［11］。目前，CEP已被證明可抑制多種癌癥進(jìn)展，如UNSON等［12］發(fā)現(xiàn)CEP可通過抑制P53突變抑制結(jié)直腸細(xì)胞生長(zhǎng)。TANG等［13］發(fā)現(xiàn)CEP通過抑制自噬抑制非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展。但CEP在PCa中的作用尚未見報(bào)道。本研究表明，CEP（10、20μmol/L）能夠顯著抑制PCa細(xì)胞DU145增殖，且呈劑量依賴性。

研究表明，EMT在胚胎發(fā)育、傷口愈合、癌癥轉(zhuǎn)移和耐藥性中具有關(guān)鍵作用［14-15］。經(jīng)歷EMT的細(xì)胞從極化上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨瓤梢苿?dòng)的間充質(zhì)表型，該表型可增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲和遷移能力［15］。因此，抑制PCa細(xì)胞EMT進(jìn)程可作為轉(zhuǎn)移性PCa的潛在治療方法。本研究顯示，CEP（10、20μmol/L）處理后，DU145細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白（Vimentin、Snail和E-cadherin）表達(dá)受到影響，同時(shí)細(xì)胞侵襲和遷移能力被明顯抑制，表明CEP不僅可抑制PCa細(xì)胞DU145增殖，同時(shí)可抑制其轉(zhuǎn)移。

PI3K-AKT信號(hào)通路是癌癥的經(jīng)典通路之一，不僅參與癌細(xì)胞增殖，同時(shí)調(diào)控癌癥干細(xì)胞樣特性及EMT［16］。LI等［17］研究證實(shí)，淫羊藿苷Ⅱ通過抑制PI3K-AKT信號(hào)通路降低PCa細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移能力。已有研究證實(shí)CEP通過下調(diào)p-AKT表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖［18］。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法證實(shí)在DU145細(xì)胞中，CEP具有調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路的能力，且PI3K-AKT信號(hào)通路激活劑可逆轉(zhuǎn)CEP對(duì)DU145細(xì)胞EMT的影響。

綜上，CEP可能通過調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路影響PCa細(xì)胞DU145增殖、EMT、侵襲和遷移，為臨床應(yīng)用CEP治療PCa提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。