下調lncRNA CRNDE表達抑制膀胱癌細胞增殖并誘導細胞凋亡①

黃潤華 李利軍 陳思媛 田雪梅 王 帆

（四川省醫學科學院·四川省人民醫院（成都電子科技大學附屬醫院）手術室，成都 610072）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是中國最常見的泌尿外科惡性腫瘤，近年來發病率迅速上升［1-2］。盡管早期診斷和先進治療顯著改善了BC患者的預后，但BC晚期患者的生存率仍不足五年［3-4］。因此，探索BC腫瘤發生的分子機制及尋找新的治療靶點尤為迫切。研究表明，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤細胞周期、腫瘤細胞侵襲轉移與化療耐藥等相關信號通路中均發揮調節作用，其作用類似于癌基因或抑癌基因［5］。結直腸癌差異表達lncRNA CRNDE（colorectal neoplasia differentially expressed）位于16號染色體，最初被鑒定為結直腸癌中的lncRNA，并以反義方向從鄰近的IRX5基因轉錄［6］。研究表明lncRNA CRNDE可作為miR-145的分子海綿來促進胃癌細胞的增殖和遷移［7］。CHENG等［8］研究表明CRNDE在BC組織和細胞系中顯著上調，BC患者中CRNDE的過度表達與較高的TNM分期密切相關。本文主要研究CRNDE在體內和體外對BC的作用，為BC的靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 12只雄性SPF級BALC/c裸鼠，4～6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK（京）2016-0011］；人BC細胞系T24、5637、UM-UC-3和正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1購自中國科學院細胞生物學研究所（上海）；DMEM細胞培養液、胎牛血清（美國Invitrogen公司）；結晶紫（美國Sigma公司）；反轉錄試劑盒、SYBRGreen PCRMaster Mix試劑盒（日本TaKaRa公司）；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD Pharmingen公司）；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑、TUNEL細胞凋亡試劑盒（美國Thermo Fisher公司）；CCK-8試劑、RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL顯色液（上海碧云天公司）；兔抗ACTIN多抗（ab8227）、兔抗生存素（Survivin）單抗（ab134170）、兔抗胱天蛋白酶3（caspase-3，cas3，ab184787）、兔抗cas-9單抗（ab185719，英國Abcam公司）；3個不同的干擾序列CRNDE-shRNA-1、2、3和陰性對照shRNA-NC均由上海吉瑪公司設計合成；實驗所用引物采用Primer3 Input網站設計，由生工生物公司合成；FACScan流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Nanodrop 2000（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人BC細胞系T24、5637、UM-UC-3和正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1在含1%青霉素-鏈霉素溶液和10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37℃、含5%CO2的濕化培養箱中培養。

1.2.2 細胞轉染及分組處理 細胞在6孔板中匯合度達70%時使用Lipofectamine 2000分別將shRNA-NC、CRNDE-shRNA1、2、3轉染至T24細胞，記為shRNA-NC組、CRNDE-shRNA1、2、3組，Control組只轉染Lipofectamine 2000試劑。

1.2.3 RT-qPCR實驗檢測基因mRNA表達量 用TRIzol試劑從1.2.1所述細胞系和1.2.2分組轉染細胞中提取總RNA，采用Nanodrop 2000測定RNA的純度和濃度。取等質量的總RNA作為模板，根據制造商說明書，使用反轉錄試劑盒轉錄成cDNA。以cDNA為模板，按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒步驟進行RT-qPCR。反應條件為：95℃10 min；95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環。以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCt法計算相對表達量。引物序列如下：lncRNA CRNDE正向引物5＇-CGCGCCCGCGCGGCGGAGGA-3＇，反向引物5＇-TATGAATTGCAGACTTTGCAGA-3＇；GAPDH正向引物5'-GTCAGCCGCATCTTCTTTTTTG-3'，反向引物5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'；增殖細胞核抗原（Ki67）正向引物5＇-GAGCTAAATGAGAACAAGGAGCTA-3'，反向引物5＇-CCATGCTTTAAACATTCCGACT-3'；Survivin正 向 引 物5＇-TGCCCCGACGTTGCC-3＇，反向引物5＇-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3＇。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞增殖 將1.2.2分組轉染后的T24細胞以1 000個/孔接種于6孔板中培養2周。采用4%多聚甲醛固定細胞10 min，1%結晶紫染色5 min。可見克隆用倒置顯微鏡成像和手工計數，最后計算克隆形成率，克隆形成率（%）=（克隆數/接種細胞數）×100%。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 胰蛋白酶消化1.2.2分組轉染細胞，用預冷PBS（0.15 mol/L，pH=7.2）洗滌2次。將細胞以3 000 r/min離心5 min，棄上清，并將沉淀以1.0×105～1.0×106個/ml的密度重懸于1×結合緩沖液。將100μl樣品溶液轉移至5 ml培養管中，并與5μl FITC偶聯的Annexin V和5μl PI在室溫下于黑暗中孵育15 min。向每個樣品管中加入400μl 1×結合緩沖液，使用FACScan流式細胞儀進行流式分析，數據使用FlowJo軟件進行分析。

1.2.6 蛋白質印跡檢測蛋白表達 采用RIPA裂解緩沖液提取1.2.2分組轉染的細胞總蛋白。BCA測定蛋白濃度并調平，取20μg蛋白經12%SDSPAGE分離蛋白，并將其轉移至PVDF膜。以5%脫脂牛奶在TBST中封閉1 h后，caspase-3（1∶1 000）、caspase-9（1∶1 000）和ACTIN（1∶1 000）一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶3 000）37℃孵育1 h；洗膜后ECL曝光成像并用Quantity One軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.7 裸鼠成瘤實驗 12只雄性SPF級BALC/c裸鼠飼養于無特定病原體條件下，在25℃下進行12 h光照/黑暗循環，并自由進食飲水。轉染CRNDEshRNA1和shRNA-NC的T24細胞以2×106個/ml分別皮下注射到裸鼠側面（每組6只小鼠）。每5 d檢測1次腫瘤體積（V），直到處死小鼠。根據以下公式計算腫瘤體積：V=0.5×長度×寬度2。30 d后，以頸脫位法處死小鼠，并通過手術切除腫瘤，拍照，稱重并進行石蠟包埋切片，以進行后續實驗。

1.2.8 免疫組化檢測Survivin 將1.2.7保存的腫瘤組織石蠟切片脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液修復，滴加一抗至切片，4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶蛋白親和素，37℃下作用40 min，洗滌后避光顯色并以蘇木素復染細胞核。封片后使用光學顯微鏡觀察Survivin陽性細胞。

1.2.9 TUNEL細胞凋亡檢測 將1.2.7保存的腫瘤組織石蠟切片脫蠟，按照TUNEL細胞凋亡試劑盒說明書操作染色，封片后使用光學顯微鏡觀察凋亡細胞。

1.3 統計學分析 所有數據均為至少3次重復實驗的統計結果，表示為±s。使用SPSS18.0軟件進行分析，組間數據比較通過獨立的t檢驗進行統計分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA CRNDE的表達 人BC細胞系T24、5637、UM-UC-3中CRNDE的表達較正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1顯著上調（P＜0.05），見圖1A。與對照組相比，shRNA-NC組CRNDE表達水平差異無統計學意義，CRNDE-shRNA 1、2、3組CRNDE表達量均明顯降低（P＜0.05），且CRNDE-shRNA1組中CRNDE表達量最低，見圖1B，因此采用CRNDEshRNA1序列進行后續實驗。

圖1 RT-qPCR檢測CRNDE表達Fig.1 RT-qPCR was commended to measure expression of CRNDE

2.2 下調lncRNA CRNDE抑制T24細胞增殖 與對照組相比，CRNDE-shRNA1組T24細胞克隆形成率明顯降低（P＜0.05），Ki67和Survivin的表達量均顯著下調（P＜0.05），shRNA-NC組差異無統計學意義，見圖2。

圖2 下調lncRNA CRNDE對T24細胞增殖的影響Fig.2 Effect of down-regulation of lncRNA CRNDE on T24 cells proliferation

2.3 下調lncRNA CRNDE誘導T24細胞凋亡 對照組、shRNA-NC組和CRNDE-shRNA1組細胞凋亡率分別為（4.7±2.3）%、（4.9±2.0）%和（28.0±3.0）%，shRNA-NC組細胞凋亡率較對照組差異無統計學意義（P＜0.05），CRNDE-shRNA1組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05，圖3A、B）。與對照組相比，shRNA-NC組cleaved cas3/cas3和cleaved cas9/cas9差異無統計學意義，CRNDE-shRNA1組cleaved cas3/cas3和cleaved cas9/cas9顯著升高（P＜0.05，圖3C）。

2.4 下調lncRNA CRNDE抑制裸鼠移植瘤的生長 在30 d時，CRNDE-shRNA1組腫瘤體積（約800 mm3）僅為shRNA-NC組（約2 400 mm3）的1/3，腫瘤體積明顯減小（P＜0.05），腫瘤重量也明顯低于shRNA-NC組（P＜0.05），見圖4。

圖4 下調lncRNA CRNDE對裸鼠移植瘤生長的影響Fig.4 Effect of down-regulation of lncRNA CRNDE on growth of transplanted tumors in nude mice

2.5 下調lncRNA CRNDE誘導腫瘤組織中癌細胞的凋亡 CRNDE-shRNA1組細胞凋亡率（47±9）%相較于shRNA-NC組（3±3）%顯著增加（P＜0.05），見圖5A；與shRNA-NC組相比，CRNDE-shRNA1組Survivin陽性細胞明顯減少（P＜0.05），見圖5B。

圖3下調lncRNA CRNDE對T24細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of down-regulation of lncRNA CRNDE on T24 cell apoptosis

圖5 下調lncRNA CRNDE對腫瘤組織細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of down-regulation of lncRNA CRNDE on apoptosis in tumor tissue

3 討論

CRNDE是一種眾所周知的致癌lncRNA，在包括BC在內的多種癌癥中表達上調［8-10］。失調的lncRNA通過多種機制在BC的發生發展中發揮至關重要的作用，其可在與蛋白質、miRNA和mRNA相互作用的過程中充當向導、支架和分子海綿，從而形成復雜的信號調節網絡［11-12］。CRNDE的高表達與癌癥患者的臨床病理特征和預后不良密切相關，包括TNM分期、淋巴結轉移、組織學分級和遠處轉移［13-14］。此外，CRNDE過表達可增強癌細胞的惡性表型，如增殖和遷移能力增強、凋亡細胞減少和細胞快速生長等［15-17］。研究表明CRNDE在神經膠質瘤中顯著上調，并通過激活mTOR促進細胞的增殖、遷移和侵襲［16］。本研究結果表明，人BC細胞中CRNDE表達顯著上調，下調CRNDE表達可顯著減少T24細胞的集落形成，并下調Ki67和Survivin mRNA表達。細胞增殖標記蛋白Ki67的表達水平可用于評估細胞的增殖能力［18］。Survivin是目前已經發現的最強的凋亡抑制因子之一，可直接作用于caspase，主要通過黏附于活化的caspase-3、7參與細胞凋亡，通過調節細胞周期，使腫瘤細胞逃逸G2/M檢測關卡而獲得惡性增殖潛能［19］。因此下調CRNDE表達可顯著抑制BC細胞增殖。

腫瘤細胞中凋亡減弱、誘導腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的主要方式之一。LI等［20］研究表明，敲低lncRNA CRNDE表達能夠增加肝癌細胞中Bax和cleaved caspase-3表達，并降低Bcl-2表達，從而誘導細胞凋亡。Caspase-9是起始凋亡蛋白酶，線粒體釋放細胞色素C并通過其與caspase-9前體結合形成凋亡復合物，激活caspase-9介導的線粒體信號凋亡通路引起細胞凋亡［21］。Caspase-3是細胞凋亡過程中的執行凋亡蛋白酶，可導致DNA片段化和細胞骨架破壞等一系列引起細胞凋亡的事件［22］。本研究表明下調CRNDE表達可顯著增加細胞凋亡率，并上調活化caspase-3和活化caspase-9蛋白表達。提示下調lncRNA CRNDE可能通過激活caspase途徑誘導BC細胞凋亡。

體內實驗表明，沉默CRNDE表達可抑制裸鼠移植瘤的體積和重量［23］。本研究結果表明下調lncRNA CRNDE能有效抑制小鼠體內BC的腫瘤生長，并增加腫瘤組織中TUNEL陽性細胞率，抑制凋亡因子Survivin表達。因此下調lncRNA CRNDE能夠阻止BC腫瘤的發展進程。

綜上所述，lncRNA CRNDE在人BC中高表達，下調lncRNA CRNDE能夠抑制BCT24細胞增殖，通過caspase途徑誘導細胞凋亡，可有效阻止異種移植腫瘤的生長。但CRNDE在BC中的分子作用機制尚不明確，仍需進一步探索。總之，本研究揭示了CRNDE在BC中的生物學功能，預示CRNDE可能成為治療BC的新靶標。