一種基于突變型IgG4長鉸鏈區和4-1BB共刺激域的靶向CD19 CAR-T細胞構建及抗白血病的功能研究①

張 燦 安志靜 白 玥 王琛琛 鐘曉松

（首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院臨床基因與細胞工程中心，北京 100038）

近年來，嵌合抗原受體T細胞（chimeric antigen receptor，CAR-T）免疫療法在治療惡性血液腫瘤中具有顯著療效，特別是在治療急性淋巴細胞白血病中，完全緩解率可達到70%～90%，但大部分靶向CD19的CAR-T細胞（CART19）臨床試驗均有較高的復發率，這與CAR-T細胞在體內持續性短密切相關，而造成持續性短的主要原因是CAR分子結構的問題，CAR的結構主要包括4部分，分別是抗原結合域（scFv）、鉸鏈區（間隔區）、跨膜區以及胞內信號區［1-3］。有文獻報道轉染含有4-1BB共刺激域的CAR-T細胞在體內存在時間長，并且采用突變型IgG4長鉸鏈區可以延長T細胞的體內抗腫瘤作用［4-5］。因此，本課題組構建了一種基于突變型IgG4長鉸鏈區和4-1BB共刺激域的CAR，并在體內外驗證其功能。

1 材料與方法

1.1 材料 K562、NALM-6和PG-13細胞系購自ATCC公司。NGFR-K562、CD19-K562和NALM6-GL細胞均由實驗室構建，方法參考文獻［6］。所有細胞系支原體檢測均為陰性；RPMI1640培養基和DMEM培養基購自Lonza公司；淋巴細胞分離液購自美國MP公司；PHA購自Sigma公司；胎牛血清購自Thermo公司；重組人IL-2購自雙鷺藥業；所有流式抗體均購自美國BD公司；IFN-γELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司；D-蟲熒光素鉀鹽購自橋生物公司；SPF級NOD/SCID小鼠購自北京維通利華實驗動物技術公司，飼養于首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院的SPF級動物房，實驗動物所有操作程序均由實驗動物倫理委員會批準。逆轉錄病毒質粒及包裝體系均為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 突變型IgG4長鉸鏈區和4-1BB共刺激因子CAR的逆轉錄病毒的構建和包裝 本實驗室前期構建了MSGV-FMC63-28Z質粒，設計突變的IgG4長片段來源的鉸鏈區及4-1BB共刺激域對CAR結構進行改造，采用PG-13病毒包裝體系制備逆轉錄病毒，高速離心后-80℃保存［6-8］。以空質粒包裝的逆轉錄病毒載體作為對照病毒Mock組。

1.2.2 CART19細胞的制備 采集多位健康志愿者外周血，經淋巴細胞分離液分離出外周血單核細胞（PBMC），采用PHA刺激活化T細胞［9］。經逆轉錄病毒轉導，次日換含有IL-2的完全培養基進行CART細胞擴增，在轉導后4 d采用流式細胞儀檢測病毒轉導效率，并用Western blot驗證是否表達外源性

CD3ζ［6］。

1.2.3 腫瘤細胞對CART19細胞的特異性激活

1.2.3.1 IFN-γ胞內染色 按照效靶比10∶1將效應細胞（CART19細胞）與腫瘤細胞（NALM6-GL和K562-CD19）共培養，期間加入1μl的Golgi Stop，6 h后收集細胞，按照IFN-γ胞內染色標準流程進行流式檢測。

1.2.3.2 CD107a脫顆粒實驗 按照效靶比10∶1將效應細胞（CART19細胞）與腫瘤細胞（NALM6-GL和K562-CD19）共培養，期間加入1μl CD107a抗體和1μl的Golgi Stop，6 h后收集細胞，染色CD3、CD4和CD8后進行流式細胞儀檢測。

1.2.3.3 CFSE增殖實驗 在第0天將CART19用PBS清洗后進行1μmol/L CFSE熒光染色20 min，再用含有2%FBS的PBS終止染色，PBS清洗2遍后流式檢測初始熒光值，按照效靶比2∶1將CART19和NALM6-GL和K562分別避光共培養4 d，收集細胞流式檢測。

1.2.4 評估CART19細胞對腫瘤細胞的殺傷能力和細胞因子釋放能力

1.2.4.1 4 h共培養熒光殺傷實驗 按照效靶比10∶1將效應細胞（NT、Mock和CART19細胞）與腫瘤細胞（NALM6-GL）共培養4 h，加入D-蟲熒光素鉀稀釋至150μg/ml，采用Xenogen IVIS成像系統進行熒光拍照，殺傷率基于孔中的腫瘤細胞的熒光值，計算公式：殺傷率（%）=100-（效應細胞和靶細胞共培養熒光值/靶細胞熒光值）×100%。

1.2.4.2 ELISA法檢測IFN-γ釋放 按照效靶比10∶1將效應細胞（NT、Mock和CART19細胞）與腫瘤細胞（NALM6-GL和K562-CD19）共培養24 h，收集上清離心后，用ELISA標準方法檢測IFN-γ的分泌量。

1.2.5 體內實驗評價CART19細胞的抗腫瘤能力 6周齡雌性NOD/SCID小鼠尾靜脈注射1×106個的NALM6-GL細胞建立急性淋巴細胞白血病小鼠模型，于建模第2～4天連續3 d注射Mock細胞和CART19細胞5×106個/次，每組3只，每周采用Xenogen IVIS成像系統進行熒光拍照，并計算生存率。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 5軟件進行數據統計，數據以±s表示，每組實驗至少獨立重復3次，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 載體構建、病毒包裝及轉導效率評估 采用鼠源CD19 scFv、突變型IgG4鉸鏈區、CD28跨膜域和胞內活化信號4-1BB以及CD3ζ構建了逆轉錄病毒載體質粒（圖1A）。采用制備的CART19逆轉錄病毒及對照組病毒轉染活化的T細胞，流式細胞儀檢測轉染效率分別為20.60%和1.43%（圖1B）。Western blot檢測轉染細胞人源CD3ζ的表達，結果顯示，與NT和Mock組相比，CART19組外源性CD3ζ的表達顯著（圖1C）。

圖1 CART19的設計及轉導T細胞的表達Fig.1 CART19 design and expression in transduced T cells

2.2 CART19可特異性識別CD19+腫瘤細胞并表達IFN-γ、脫顆粒 流式細胞儀檢測CART19細胞的IFN-γ和CD107a的表達，結果顯示與CD19-細胞系共培養相比，CD19+細胞系可以明顯刺激T細胞表達IFN-γ以及發生脫顆粒（圖2A、B）。通過流式細胞儀檢測CART19細胞的CFSE表達，結果顯示與CD19-細胞系共培養相比，CD19+細胞系可以明顯刺激T細胞增殖（圖2C）。

圖2 CD19特異性刺激CART19細胞表達IFN-γ和CD107aFig.2 CD19 specifically stimulates expression of IFN-γand CD107a in CART19 cells

2.3 CART19細胞可以特異性殺傷CD19+腫瘤細胞并釋放IFN-γ 按照不同效靶比（E∶T）將效應細胞同NALM6-GL共培養4 h，結果顯示隨著效靶比的不斷增加，CART19對靶細胞的殺傷逐漸增強，而NT及Mock T細胞組無明顯變化（圖3A）。在此選取效靶比10∶1進行24 h的共培養，收取培養上清液進行IFN-γ的ELISA檢測，結果顯示在靶細胞為NALM6-GL的共培養中，CART19組的IFN-γ的釋放明顯高于NT組和Mock組，在靶細胞為K562-CD19的共培養中，CART19組的IFN-γ的釋放也明顯高于NT組和Mock組，差異具有統計學意義（P＜0.001，圖3B）。

2.4 CART19細胞在急性淋巴白血病小鼠中的抗腫瘤作用 為了評估CART19在體內的功能，采用NALM6-GL尾靜脈注射建立急性淋巴細胞白血病的小鼠模型（圖4A）。與Mock組相比，注射CART19細胞組的小鼠腫瘤負荷明顯減輕（圖4B），Mock組小鼠在35 d內全部死亡，而CART19細胞組小鼠在44 d均存活，CART19細胞組的生存率也明顯提升（圖4C）。結果顯示構建的CART19在體內具有明顯的抗腫瘤作用。

圖4 CART19細胞在體內表現出顯著的抗白血病效應Fig.4 CART19 cells display significant antileukemic activity in vivo

3 討論

CAR-T免疫療法在治療血液系統惡性腫瘤特別是B細胞惡性腫瘤已經取得成果［10-11］，經過治療70%～90%的B系急性淋巴細胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者可以達到完全緩解，然而隨著更多長期隨訪數據的公布，CAR-T治療后的高復發率也成為CAR-T發展的最大障礙，其中CD19 CAR-T細胞在體內缺乏持久性是造成CD19+陽性復發的重要原因［1-2］。TURTLE等［12］研究發現，CD19+陽性復發僅發生在沒有持續性CAR-T細胞的患者中，因此提高CAR-T細胞在體內的持續性是降低CD19+復發的重要手段之一。CAR結構中與CAR-T細胞在體內持久性關聯較多的研究是共刺激域部分，CD28和4-1BB是目前研究最多的兩種共刺激域分子，多項研究表明，相比于CD28，含有4-1BB共刺激域的CAR-T細胞在體內存活時間更長［4，13］。CD19-28ζ的CAR-T細胞在體內的中位存活時間是3個月，而有68%CD19-BBζCAR-T細胞超過了6個月，最長高達20個月，因此在CAR結構設計重點是含有4-1BB對維持CAR-T在體內的持續性［14-16］。

另外研究不多的鉸鏈區結構對CAR-T細胞的功能也有十分重要的作用［17］。有研究表明來源于突變型的IgG4長鉸鏈區可以促進抗腫瘤作用，首先IgG4與高親和力受體FcγR1（CD64）的結合力較低，其次長片段可以增強單鏈可變區（scFv）的靈活性從而緩解CAR與腫瘤抗原的空間限制，進而促進CAR-T細胞和靶細胞之間免疫突觸形成［5，18］。采用突變型的IgG4長鉸鏈區可以在不改變CAR介導的抗原裂解的同時降低與Fc-γ受體的結合，從而消除脫靶效應，進一步提高T細胞的持久性和抗腫瘤反應［7］。具體的突變位點是在IgG4鉸鏈區的CH2部分中含有2個突變點L235E和N297Q，而且這種突變既不會影響CAR的表達也不會改變CAR-T細胞對CD19+腫瘤細胞的特異性殺傷［7］。

構建這種基于突變型IgG4長鉸鏈區和4-1BB共刺激域的CAR，經過逆轉錄病毒包裝、轉導和擴增，獲得了CART19細胞。體外實驗證明了CART19細胞可以有效殺傷CD19+腫瘤細胞并分泌大量IFN-γ，并且CD19+腫瘤細胞也可以特異性刺激CART19細胞表達IFN-γ、脫顆粒以及促進增殖，體內實驗也證明CART19細胞具有抗腫瘤作用并且可以延長白血病小鼠的生存率。

除了共刺激域和鉸鏈區，CAR的結構中研究較多的還有scFv，有研究表明降低scFv親和力會提高CAR-T細胞活化的閾值，避免過度活化從而保持記憶表型，使CAR-T細胞能夠長期存活［19］；鼠源scFv的免疫原性可能會導致CAR-T細胞在體內無法持續存活，而人源化的scFv可以降低人體對CAR產生的免疫應答，有望延長CAR-T在體內的存活時間，因此本課題組可以繼續改進CAR的結構，提高CAR-T在體內的持續性，從而降低疾病復發［12］。

目前，除了改變CAR結構提高CAR-T細胞在體內持續性之外，還可通過制備來源于記憶性干細胞樣T細胞（memory stem cell T cells，Tscm）的CAR-T細胞也是提高CAR-T細胞在體內的持續性的重要方法之一。Tscm細胞不僅具有干細胞特性，還可在體外分化成中央記憶性T細胞（central memory T cell，Tcm）和效應記憶性T細胞（effector memory Tcell，Tem），提高自我更新、增殖和存活能力［20-21］，更重要的是CD19CAR修飾的Tscm細胞還具有強大而持久的抗腫瘤能力［22］，因此選擇Tscm細胞作為來源制備CAR-T細胞以增強其持久性和殺傷性。

本研究成功構建了基于突變型IgG4長鉸鏈區和4-1BB共刺激域的CAR-T細胞，為進一步研究CAR-T細胞在體內存活的機制及下一步臨床試驗奠定了基礎。