供者淋巴細胞輸注治療無效的移植后復發患者過繼性回輸NK細胞的免疫學變化和臨床療效①

曹勛紅 王志東 韓 偉 陳育紅 唐菲菲 孫于謙 王景枝 許蘭平 張曉輝 王 昱 劉開彥 黃曉軍 趙翔宇（北京大學人民醫院，北京大學血液研究所，國家血液系統疾病臨床醫學研究中心，北京 100044）

異基因造血干細胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是治療惡性血液病有效甚至唯一的手段，但移植后復發仍是移植后主要并發癥，影響移植療效。目前移植后復發常規治療方式包括化療、聯合供者淋巴細胞回輸（donor lymphocyte infusion，DLI）等，但DLI雖能明顯緩解移植后復發，卻增加了回輸后移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）發生風險。

NK細胞是機體重要的天然免疫細胞，在免疫監視和腫瘤清除過程中起重要作用。RUGGERI等［1］證實殺傷免疫球蛋白（KIR）配體不相合的異基因NK細胞在急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）患者中可發揮促進植入、抗急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，aGVHD）和抗腫瘤作用。MILLER等［2］研究報道，異基因NK細胞治療在難治復發AML患者體內有較好的安全性和一定療效。但受限于人體NK細胞數較少，NK細胞臨床應用受到限制。MASUYAMA等［3］建立了CD3聯合CD52單抗體外誘導供者來源NK細胞的擴增方法，臨床前研究證實其具有抗腫瘤作用。本研究采用CD3聯合CD52單抗體外誘導移植供者來源NK細胞擴增，并將其回輸給DLI無效的移植后復發急性白血病患者，初步研究NK細胞回輸至移植后復發患者體內的免疫學變化及臨床療效。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 入組病例及標準 入組患者8例，入組條件為2011年2月至2014年1月于北京大學血液病研究所進行allo-HSCT且移植后復發患者，患者主要臨床特點見表1。

1.1.2 預處理方案 全部采用常規改良BU/CY（白消安/環磷酰胺）方案，HLA配型不合移植預處理中加用抗胸腺細胞球蛋白（ATG）［4］。

1.1.3 干細胞動員和采集 全部患者采用骨髓聯合外周血干細胞移植，所有患者均以G-CSF動員5～6 d（-3 d開始），劑量為5μg/kg［5-6］。

1.1.4 aGVHD預防 采用環孢素（CsA）聯合霉酚酸酯（MMF）及短程甲氨蝶呤（MTX）方案［7］。

1.1.5 植活標準 連續3 d中性粒細胞絕對值（ANC）≥0.5×109L-1為粒細胞植活，連續7 d PLT≥20×109L-1為血小板植活［8］。

1.1.6 主要試劑 6色抗體組合：CD3-Percpcy5.5、CD62L-FITC（美國Becton Dickinson公司）；CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue（美國Biolegend公司）；CCR7-PECY7、NKG2C-PE（美國RD$systems公司）；8色抗體組合：CD3-Amcyan、CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、KIR-FITC、NKG2A-PE、NKG2D-Percpcy5.5、NKp30-APC，NKp46-PECY7（美國BD Bioscience公司）；CD107a-藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）及莫能霉素、Cytofix/Cytoperm試劑盒（美國Becton Dickinson公司）。

1.2 方法

1.2.1 NK細胞富集、擴增 采集健康供者來源外周血40 ml，提取單個核細胞，經抗CD3（0.1μg/ml）和抗CD52單克隆抗體（20μg/ml）于T-225瓶中共同刺激4 d，轉至新開發的含自體血漿和IL-2的NKGM-1培養基培養14 d，每3 d更換1次含IL-2的新鮮培養基［3］。流式分選擴增后的CD3-CD56+平均活率為94.475%，擴增后NK細胞平均占比為44.35%，8例患者NK細胞及T細胞擴增占比及回輸給患者的細胞數量見表2。

表2 入組患者NK細胞擴增活率、比例及回輸數量Tab.2 Expansion rates，ratio and number of NK cellsinfused into enrolled patients

1.2.2 標本留取 ①留取供者培養前及擴增后的NK細胞，流式監測NK細胞擴增前后數目、比例、凋亡及表型變化；②留取回輸后5周內外周血，1次/周，流式細胞術分別檢測CD3-CD56+NK細胞亞群動力學變化，同時檢測NK細胞IFN-γ分泌水平及殺傷活性。

1.2.3 流式細胞術檢測

1.2.3.1 NK細胞表型檢測 ①取全血100～200μl，加入6色抗體組合：CD3-Percpcy5.5、CD62L-FITC、CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、CCR7-PECY7、NKG2C-PE，避光孵育30 min，溶血，PBS洗滌后上機檢測；②取全血100～200μl，加入8色抗體組合：CD3-Amcyan、CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、KIR-FITC、NKG2A-PE、NKG2D-Percpcy5.5、NKp30-APC，NKp46-PECY7，避光孵育30 min，溶血，PBS洗滌后上機檢測；③NK細胞擴增前后表型抗體組合見文獻［9］。

1.2.3.2 NK細胞抗白血病功能檢測 采用淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞（mononuclear cells of peripheral blood，PBMC）計數，調整細胞濃度為1×106個/ml，設實驗孔及對照孔各2個，200μl/孔接種于96孔板，給予IL-2 1 000 U/ml孵育過夜，實驗孔加入K562細胞（與PBMC比例為5∶1），對照孔加入等體積RPMI1640培養基，同時每孔加入CD107a-PE及莫能霉素0.14μl孵育4 h后終止孵育，采用5色熒光標記技術標記膜表面標記及細胞內抗原表達。所用細胞膜表面免疫熒光包括CD56-APCCY7、CD57-Pacific Blue、KIR-FITC，按照Cytofix/Cytoperm試劑盒說明固定破膜后標記細胞內免疫因子IFN-γ。

1.2.4 患者移植后微小殘留病（minimal residual disease，MRD）監測 伴有重現性染色體異常的急性白血病患者，以其特征性標志基因（如ETO）作為監測指標，＞0.4%為陽性［9］；無特征性標志基因的急性白血病患者，采用WT1基因作為監測指標，＞0.6%為陽性［10］。同時采用流式細胞術檢測白血病相關免疫表型（leukemia-associated aberrant immune phenotypes，LAIPs）。于移植后1個月、2個月、3個月、4.5個月、6個月、9個月、12個月監測MRD，出現1次基因或LAIPs陽性的患者需在2周后復查。間隔2周連續2次出現基因/LAIPs陽性或同時出現基因和LAIPs陽性為MRD陽性，即分子生物學復發；骨髓中原始細胞＞5%為血液學復發。入組標準：復發患者（血液學復發和/或分子生物學復發）可給予DLI，DLI后療效不滿意患者給予NK細胞回輸治療。給予DLI和NK細胞回輸治療后繼續監測MRD。所有患者知情同意。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0及R軟件分析數據，采用非配對T檢驗進行單因素分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 入組患者臨床特點 本研究中4例接受了同胞HLA全相合allo-HSCT，4例接受了同胞HLA單倍型相合allo-HSCT，男5例，女3例。7例移植時處于完全緩解狀態；1例移植前為復發狀態。患者接受第1次供者來源NK細胞回輸的中位時間為移植后745.5 d。2020年5月隨訪終止時，共有5例患者死亡：患者1的直接死因為中樞神經系統感染，患者2死于移植后血栓性微血管病（thrombotic microangiopathy，TMA），患者7為重癥肺炎導致的呼吸衰竭，患者6和8為血液學復發。

2.2 預后 4例治療有反應。病例3：難治復發AML患者，同胞全合移植后18月余再次出現骨髓MRD陽性，伴髓外復發（皮膚），右大腿后側結節持續20余天，因放化療不耐受，接受NK細胞回輸治療，共計回輸NK細胞5次，前2次NK細胞回輸前聯合HAA化療，每次間隔時長為3～5個月，回輸后序貫IL-2一百萬單位注射2周，第1次NK細胞，回輸后結節消退，MRD轉陰，無其他不良反應，至今患者無白血病長期生存；病例4：單倍型移植后6個月AML患者骨穿MLL-MLL基因持續陽性，NK細胞回輸治療共計1次，回輸前無化療，回輸后MLL-MLL基因轉為陰性，無其他不良反應，至今患者無白血病長期生存；病例5：單倍型移植后26月骨髓增生異常綜合征（MDS）患者，MRD由陰性轉為陽性，為異常髓系幼稚細胞，經過化療（AA方案）聯合供者淋巴細胞回輸治療后2個月復查骨髓仍FCM陽性，因此接受NK細胞治療，共計回輸3次，每次間隔2個月，第1次回輸后骨髓FCM即轉陰，無其他不良反應，至今患者無白血病長期生存；病例7：同胞全合移植后13月余B-ALL患者，骨穿WT1由陰性轉為陽性，FCM結果提示有異常髓系幼稚細胞，經過化療聯合供者淋巴細胞回輸2個月復查骨穿WT1仍為1.1%，接受NK細胞治療，共計回輸5次，前3次回輸前聯合COPD方案化療，每次間隔2個月左右，第2次回輸后WT1為0.23%，但第3次回輸后骨髓FCM表型異常且WT1為0.88%，因WT1和免疫殘留持續陽性，DLI后隨之行第4、5次NK細胞回輸，第5次回輸后WT1為0.17%，骨髓FCM轉陰，回輸過程中無其他不良反應，但在allo-HSCT后1年死于重癥肺炎導致的呼吸衰竭；4例治療無反應：病例1、2、6、8，其中1例為持續MRD陽性，3例為血液學復發，經過NK細胞聯合化療或DLI治療后分子學及血液學復發指標均未得到緩解。患者1：難治復發AML患者，同胞全合移植后30個月，腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）-FCM陽性，骨髓FCM表型異常，第1次FLAG化療序貫NK細胞回輸治療后CSF-FCM轉陰，骨髓FCM轉陰，回輸后2個月骨髓FCM復陽，行HAA方案化療聯合2次NK細胞回輸，此后骨髓及腦脊液FCM仍復陽，回輸期間無不良反應，最終因中樞神經系統感染死亡；患者2：單倍型移植后24個月B-ALL患者，回輸前骨髓原始細胞占7%，增生V級，DLI治療后2個月共計回輸NK細胞2次，回輸后因持續粒缺未評估，最終因重度GVHD及TMA死亡；患者6：MRD持續陽性AML患者，單倍型移植后15月余AML1-ETO為98.7%，接受NK細胞回輸治療，回輸前無化療，共計回輸1次，回輸后降至3.5%，無其他不良反應，最終死于血液學復發；患者8：難治復發AML患者，同胞全合移植后4月余ETO為56%，外周原始細胞占50%，DLI后行NK細胞回輸治療，共計回輸1次，回輸前未接受化療，回輸后再次給予化療，無其他不良反應，肝臟GVHD未加重，但最終死于血液學復發。

2.3 體外擴增NK細胞的生物學特性 采用CD3聯合CD52單抗方法體外擴增健康供者外周血來源NK細胞，結果發現，供者來源NK細胞擴增后表型以早期不成熟亞群為主，主要表現為NKG2A+NK細胞培養后明顯增加，而CD57+亞群明顯下降，CD3-CD56dimCD57+KIR+擴增前后差異無統計學意義（圖1A）。NK細胞功能發揮取決于活化型及抑制性受體平衡，采用流式細胞術監測擴增前后NK細胞活化型受體及抑制性受體變化（圖1B、C），擴增后NK細胞表面NKG2D、DNAM-1及NKP30平均熒光強度明顯上調，同時，抑制性受體CTLA-4、PD-1、Tim-3及Tigit平均熒光強度表達擴增后也明顯增強。由于CD69及CD25在NK細胞高表達可分別指示NK細胞殺傷能力及增殖水平提升，本研究對此進行評估并發現擴增后NK細胞表面CD25及CD69平均熒光強度明顯高于擴增前，提示擴增后NK細胞被活化（圖1E、F）。NK細胞組織異質性高且在不同組織臟器中發揮重要作用，其體內循環與表面趨化型因子表達密切相關，本研究發現擴增后NK細胞表面CXCR3、CX3CR1及4-1BB平均熒光強度較擴增前明顯增強，說明擴增的NK細胞組織趨化能力提升（圖1D）。

圖1 NK細胞擴增前后表型變化Fig.1 Phenotype changes before and after expansion of NK cells

2.4 NK細胞體內回輸后淋巴細胞數量動力學變化 所有接受NK細胞回輸后的病例白細胞總數及淋巴細胞總數恢復動態規律如圖2A、B所示，其在有反應患者與無反應患者中恢復規律無明顯差異。而有反應組患者（病例3、4、5、7）T細胞比例（占淋巴細胞百分比）在與無反應患者相比無明顯規律，但回輸后第2周除病例8外，無反應組T細胞比例均低于有反應組（圖2C），尤其是回輸后前3周無反應組T細胞比例低于有反應組（圖2D），說明回輸后T細胞也可能參與抗腫瘤作用。

圖2 NK細胞回輸后體內各細胞數量動力學變化Fig.2 Dynamic changes of other cell number in vivo after NK cell infusion

2.5 NK細胞回輸后體內亞群動力學變化 有反應組（病例3、4、7）CD56brightNK細胞亞群整體恢復水平明顯高于無反應組（病例1、2、6），而無反應組患者8的CD56brightNK細胞亞群恢復效果中整體水平高于有反應組病例5（圖3A），各病例CD56dimNK細胞亞群恢復趨勢與CD56brightNK細胞相反（圖3B）。NK細胞表面NKG2A表達與NK細胞治療后反應無明顯相關性，治療無反應組病例6及病例1NKG2A亞群分布在NK細胞回輸治療后始終處于較低水平，雖然病例1治療1周后NKG2A表達約達60%，但治療后第2周迅速下降，而后在3、4周維持在30%左右，其他病例則在回輸治療后5周內維持相對較高水平，變化趨勢也較為平穩（圖3C）。CD57+NK細胞亞群的病例恢復趨勢與KIR+NK細胞一致，即有反應組（病例4、5、7）亞群水平明顯高于無反應組，提示NK回輸治療后對腫瘤細胞的殺傷可能依賴于成熟NK細胞亞群功能發揮；進一步亞群成熟度分析也提示無反應組（病例1、2、8）CD56dimNKG2A-CD57-KIR-比例明顯高于有反應組（病例3、4、5、7），兩組間其他亞群趨勢變化無規律（圖4A、B）。

圖3 NK細胞回輸后體內亞群動力學變化Fig.3 Dynamic changes of NK subsets in vivo post NK cells refusion

圖4 回輸后無反應和有反應患者不同時間點不同成熟度NK細胞亞群（CD56bright、CD56dimNKG2A+、CD56dimNKG2AKIR-CD57+、CD56dimNKG2A-KIR-CD57-、CD56dimNKG2AKIR+CD57-、CD56dimNKG2A-KIR+CD57+）動態變化Fig.4 Different maturity levels of NK subsets（CD56bright，CD56dimNKG2A+，CD56dimNKG2A-KIR-CD57+，CD56dim NKG2A-KIR-CD57-，CD56dim NKG2A-KIR+CD57-，CD56dimNKG2A-KIR+CD57+）at different time points between patients with response to NK infusion and those without response

2.6 NK細胞回輸后的活化型受體及功能動力學變化 NK細胞回輸后治療反應良好病例3、4、5、7的NKG2D、NKp30及NKp46占NK細胞比例均明顯高于無反應治療患者，均在60%以上，且隨著移植時間推移，治療反應良好病例上述水平呈上升趨勢。而NKG2C占NK細胞的比例在治療反應良好組與無反應治療組未顯示差異性趨勢。NK細胞治療有反應病例（病例3、4、5、7）CD107a在NK細胞中的表達趨勢明顯高于治療無反應患者。而NK細胞IFN-γ分泌水平在NK細胞治療后趨勢并不明顯，NK細胞分泌IFN-γ的水平除病例4在第3周達到峰值，且明顯高于其他患者分泌水平，但其在第4周又驟降至基線水平，基本恢復至其他7例在NK細胞治療過程中的基準（圖5）。

圖5 NK細胞回輸后活化型受體NKG2D、NKp30、NKp46、NKG2C動力學變化及細胞脫顆粒、IFN-γ因子分泌能力變化Fig.5 Dynamic changes of activated receptors NKG2D，NKp30，NKp46，NKG2C and degranulation and secretion of IFN-γafter NK adoptivetransfer

2.7 安全性評價 病例2接受NK細胞治療前有活動性GVHD和TMA，NK細胞治療后GVHD和TMA無明顯變化，病例3、6的GVHD癥狀在NK細胞回輸治療后明顯緩解，其中1例回輸前全身皮膚菲薄，雙上肢散在紅色皮疹，口腔內多發潰瘍，回輸后cGVHD活動性癥狀緩解；另一例移植后慢性GVHD肝臟表現，回輸后癥狀緩解，提示NK細胞治療可能發揮抗GVHD功能，需進一步研究。

3 討論

NK細胞是機體重要的天然免疫細胞，無需預先致敏便可識別殺傷腫瘤細胞和病毒感染的細胞，在免疫監視和腫瘤清除過程中起重要作用。HLA半相合健康供者由于缺少部分NK細胞免疫球蛋白受體，部分減弱了抑制性受體對NK細胞功能的影響，可更好發揮腫瘤殺傷能力，因此增強NK細胞功能或過繼性回輸NK細胞療法已逐漸成為造血干細胞移植中抗白血病治療的重要觀念［11］。目前研究認為，體內NK細胞與腫瘤細胞效靶比越高，清除腫瘤能力越強。健康人群獲取的NK細胞數有限，越來越多體外擴增技術興起彌補了NK細胞數不足的問題。MASUYAMA等［3］通過CD3聯合CD52單抗體外刺激人外周血單核細胞后發現，NK細胞擴增效率高，抗腫瘤功能增強，該體系的建立摒棄了耗時的去T細胞步驟及體外飼養層細胞準備，但該技術擴增的NK細胞在保證安全性前提下是否對人類具有一定治療效果尚無報道。基于此，課題組對移植后復發或持續MRD陽性患者過繼性回輸體外供者來源NK細胞，并監測了回輸后5周內NK細胞亞群及功能動力學變化，初步探討以CD3聯合CD52單擴增的NK細胞在體內的動態變化及臨床療效。

本研究提示，以CD3聯合CD52單抗對NK細胞的體外擴增效率高，殺傷功能強，從目前8例結果來看，有3例MRD陽性患者于NK細胞回輸治療后轉陰，1例髓外（皮膚）緩解，但對血液學復發無效，對中樞神經系統白血病復發有待進一步研究。提示NK細胞主要優勢是清除體內微小殘留病，而對血液學復發患者療效不佳。ZHAO等［12］在小鼠NCG血液瘤模型中過繼性回輸經mbIL-21/4-1BBL擴增的NK細胞證實，大劑量和連續多次回輸NK細胞有利于腫瘤清除，臨床研究也證實，對鞏固治療期間持續微小殘留病陽性患者接受氟達拉濱聯合環磷酰胺預處理或常規鞏固治療聯合單倍型供者來源NK細胞回輸可誘導50%～60%微小殘留病轉陰，且無明顯不良反應。雖然MILLER等［2］研究表明過繼性NK細胞回輸治療難治復發患者取得了一定療效，但誘導難治復發白血病患者緩解率也僅有20%～30%，提示NK細胞抗白血病治療仍有較大提升空間，通過改造NK細胞提高其體內存活時間，或通過多次、高劑量NK細胞回輸有望提高NK細胞抗腫瘤能力。

NK細胞活化功能可分為兩方面：一是基于NK細胞成熟度而定，隨著NK細胞發育分化成熟，細胞殺傷能力逐漸增強；二是取決于其表面活化型受體與抑制型受體平衡。本研究中，NK細胞成熟指標CD57及KIR表達在有反應組均明顯高于無反應組，提示腫瘤個體異質性對NK細胞影響不一，也從側面反映腫瘤負荷減低可能與回輸后NK細胞成熟度有關［13］。同時，NK細胞表面活化型受體NKp30、NKp46及NKG2D表達在有反應組均明顯高于無反應組，說明NK殺傷能力指標CD107a分泌水平也在有反應組趨勢較高，進一步說明回輸后活化型受體占比更多的NK細胞在腫瘤細胞患者中預后更好［14-15］。提示腫瘤清除可能與NK細胞功能恢復相關，與KHAZNADAR等［16］報道一致，即NK細胞采用免疫調節劑恢復部分功能后，與AML細胞系接觸增多，殺傷作用增強。

移植后復發患者采用過繼性NK細胞回輸治療，無不良反應，且2例患者慢性GVHD癥狀緩解，提示安全性良好，但由于樣本量較少，且CD3聯合CD52體外擴增NK細胞的策略與目前其他飼養層細胞的擴NK細胞策略是否有明顯優越性尚不可知。YANG等［17］通過RNA-seq技術探究兩種不同擴增體系的NK細胞轉錄本差異，發現221-mIL-21飼養層細胞擴增的NK細胞相較K562-mIL-21擴增的NK細胞分化程度更低，記憶性更高，說明不同擴增體系除影響NK細胞擴增效率，也影響擴增NK細胞自身生物學功能。提示后續評估NK細胞治療效率時，應考慮不同擴增體系對NK細胞的影響。本研究擴增體系提示NK細胞明顯活化且組織趨化能力上調，NK細胞表面抑制性受體PD-1、Tim-3、CTLA4及Tigit熒光表達強度明顯上調。PD-1、Tim-3、CTLA-4及Tigit是阻斷T細胞及NK細胞免疫功能的重要耗竭性受體［18-20］。但也有研究認為Tim-3及Tigit在NK細胞的表達是NK細胞功能活化及成熟的重要指標，因此，需綜合評估擴增后NK細胞表面耗竭性受體表達上調對NK細胞功能的影響［21-22］。另外，本研究未充分評估對NK細胞回輸后其他免疫細胞如T細胞、B細胞、DC及巨噬細胞等表型及功能，已有研究發現T細胞、DC及巨噬細胞能直接或間接影響NK細胞發育成熟、細胞毒因子分泌功能［23-24］。NK細胞回輸后其他免疫細胞是否參與增強有反應組NK細胞功能值得進一步研究。

總之，本研究對CD3聯合CD52單抗體外擴增NK細胞后，過繼性回輸治療移植復發患者后的免疫學變化進行了初步探討，臨床應用的安全性和有效性尚需擴大樣本量及重新設計臨床研究進一步探討。