外源性重組激活基因在人類細胞中的表達研究①

曾 艷 孫洪海 王 敏 劉 旭 嚴丹丹 孫龍飛 劉志超 韋星呈（沈陽醫學院，沈陽 110034）

重組激活基因（recombination activating genes，RAGs）編碼重組酶RAG1和RAG2，二者通過特異性介導抗原受體V（D）J基因重排，在淋巴細胞分化發育中發揮關鍵作用［1-2］。V（D）J重排由每個編碼基因片段兩端的重組信號序列RSS介導，重組激活基因是該過程的主要調控基因［2-5］。RAGs的編碼產物RAG-1和RAG-2蛋白的復合物是最重要的重組酶之一，參與V（D）J重組的整個過程并發揮關鍵作用［6］。分為兩個階段：①重組激活基因RAG-1、RAG-2將DNA切割開［7］；②非同源末端連接裝置（NHEJ）將產生的斷裂DNA末端連接起來形成重排產物，見圖1。

圖1 V（D）J重組反應步驟示意圖Fig.1 Schematic diagram of V（D）J recombination reaction steps

RAGs基因的突變、重組酶的錯誤識別和異常表達均可引起嚴重的臨床疾病［8-9］，如：RAG-1或RAG-2發生的錯義突變可使其編碼的重組酶活性部分喪失，V（D）J重組發生傾向性改變，導致早期淋巴細胞發育被阻斷而導致循環中T、B細胞缺失，引起一類嚴重的聯合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency disease，SCID），臨床上統稱為Omenn氏綜合征（Omenn syndrome，OS）［10-13］。RAGs基因編碼的重組酶催化V（D）J基因重排時，發生的錯誤識別可導致抗原受體基因和癌基因染色體易位，也是淋巴系統惡性腫瘤發生的重要因素。

近年來，隨著分子生物學技術的發展和對遺傳性疾病分子機制研究的深入，基因治療相關研究取得了重大突破［14-15］。在臨床應用研究中首先獲得成功的是對腺苷酸脫氨酶（adenosine deamlnase，ADA）缺陷所致SCID的治療［16］。基因治療以其穩定性、持久性、安全性及適應性而成為極具應用價值的治療手段。

本研究擬通過恢復RAG-1、RAG-2分子的表達來挽救功能性淋巴細胞的分化、發育，探討從基因水平上根治RAG-免疫缺陷病的技術方法，為進一步應用基因治療打下良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 Jurkat（RAG+人胸腺T細胞）、293T（人胚腎細胞）購于中科院細胞庫。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco，美國）；新生牛血清（四季青，中國）；DMSO（Sigma，美國）；Total RNA提取試劑（RNAiso Reagent）、mRNA純化試劑盒、RTPCR試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒（Agarose Gel DNA Purification Kit）、DNA片段純化試劑盒、限制性內切酶、感受態大腸桿菌（JM 109）（大連TaKaRa生物工程公司）；Plasmid Midi Kit、轉染試劑盒（SuperFect Transfect Reagent）（Qiagen，德國）。

1.1.3 主要儀器 實時熒光定量PCR儀（ABI Prism 7300，美國）；紫外分光光度儀（Spectrometer Lambda 2S，PERKIN ELMER）；熒光和發光檢測儀（Turner Biosystems 20/20nLuminometer，美國）；超速離心機（日立CP100WX，日本）；微量高速冷凍離心機（Biofuge 28RS，德國）；PCR擴增儀（Biometra T3thermocycle，英國）；CO2恒溫培養箱（SHELLAB TC2323型，美國）；全溫振蕩培養箱（THZ-C-1，中國）；凝膠成像儀（UVP C-80，美國）；紫外交聯儀（SCIENTZ 03-Ⅱ，中國）。

1.2 方法

1.2.1 人類RAG-1、RAG-2表達載體構建 人類RAGs表達細胞株Jurkat（1×107個/ml）在4℃下，以1 500 r/min離心5 min，棄上清。采用RNAiso Reagent提取Total RNA。

采用mRNA分離試劑盒提取mRNA，以此為模板，經RT-PCR擴增全長RAG1、RAG2 cDNA。目的cDNA插入真核細胞表達質粒pcDNA3.1（+），獲得攜帶RAG-1（RAG-2）編碼序列的真核表達載體phR1CS（phR2CS）。

1.2.2 細胞培養 選擇生長狀態良好的人293T細胞，待細胞長至70%連片狀態時，用玻璃吸管吸棄培養液。加入0.25%胰酶1 ml（以浸沒細胞表面為宜）消化細胞并計數，按5×105個/ml分瓶傳代，以10 ml含10%新生牛血清的DMEM完全培養液培養細胞，置于含5%CO2的37℃恒溫培養箱中孵育培養。

1.2.3 真核表達載體導入人類293T細胞 接種1×105個/ml細胞孵育24 h，更換新鮮DMEM完全培養基。采用SuperFect Transfect Reagent轉染試劑盒將phRAG1 DNA 15μg、DMEM培養基200μl、Super-Fect Transfect Reagent 25μl混合均勻。室溫作用20 min后，加入10 ml DMEM完全培養基，立即混勻，加入上述培養細胞。置于含5%CO2的37℃恒溫培養箱中孵育40 h，收獲轉染細胞體。

1.2.4 RAG-1、RAG-2 mRNA表達分析 將0.25%胰酶1 ml加入轉染細胞（以浸沒細胞表面為宜），37℃孵育，顯微鏡下觀察細胞間連接消失（1～2 min），加入含10%新生牛血清的DMEM培養液5 ml中和胰酶，用吸管輕輕吹打細胞數次，使其分散后，轉移至離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清以除去胰酶。以RNAiso Reagent提取Total RNA，分別以hR1CS5-S和hR1CS5-A為正、反向引物，通過RTPCR檢測RAG-1 mRNA表達產物；分別以hR2CS5-S和hR2CS5-A為正、反向引物，通過RT-PCR檢測RAG-2 mRNA表達產物。以看家基因GAPDH作為內參照。RAG-1、RAG-2 mRNA引物序列見表1。

表1 RAG-1、RAG-2 mRNA表達分析所用引物序列及產物Tab.1 Sequences and products of primers for RAG-1，RAG-2 mRNA expression analysis

1.2.5 DNA測序 選擇經限制性內切酶酶切檢測后符合目的DNA條件的克隆，以LB液體培養基擴增，Qiagen Plasmid Midi Kit精制質粒后，以T 7 Primer、hR1CS2-S、hR1CS3-S、hR1CS4-S、pcDNA3.1 Reverse Primer為測序引物，委托上海生工生物工程技術服務有限公司測序部進行DNA測序。測序結果經BLAST軟件分析，與GenBank中RAG-1基因（Accession number：NM000448）進行比對，結果完全相同。

RAG-2操作同RAG-1，測序結果經BLAST軟件分析，與GenBank中人類RAG-2基因（Accession number：BC022397）進行比對，結果完全相同。DNA測序用引物序列見表2。

表2 DNA測序用引物序列Tab.2 Primer sequences for DNA sequencing

2 結果

2.1 RAG-1基因構建

2.1.1 RAG-1基因的克隆 從表達RAG-1的人類T細胞Total RNA中擴增的RAG-1編碼序列大小為3 219 bp（圖2）。插入pMD19-T Simple Vector后，獲得攜帶RAG-1編碼序列的載體pMD-hR1CS。

圖2 RAG-1 RT-PCR擴增產物Fig.2 RT-PCR products of RAG-l

2.1.2 RAG-1真核表達載體的構建及鑒定 以BamHⅠ和XbaⅠ將3 209 bp的目的基因片段從pMD-hR1CS切出后，插入真核細胞表達質粒pcDNA3.1（+），獲得攜帶RAG-1編碼序列的真核表達載體phR1CS（圖3）。

圖3 RAG-1真核表達載體phR1CS結構示意圖Fig.3 Diagram of vector phR1CS for RAG-1 expression in eukaryotic cells

重組質粒phR1CS經BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測進行初步鑒定，得到3 209 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）載體片段，同預期的片段大小相符（圖4）。陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序部進行DNA測序。測序結果經BLAST軟件分析，與GenBank中人類RAG-1基因（Accession number：NM000448）完全相同（附圖1，www.immune99.com）。

圖4 重組質粒p MD-hR1CS的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid p MD-hR1CS by restriction enzyme digestion

2.1.3 人類細胞中外源RAG-1的表達 采用重組質粒phR1CS轉染人源細胞株293T后，收獲孵育40 h的轉染體，提取Total RNA進行RT-PCR檢測。結果顯示，轉染細胞中可檢測到782 bp的人類RAG-1 mRNA轉錄產物，而空質粒pcDNA3.1（+）轉染的空白對照未檢測到此產物；看家基因GAPDH的RT-PCR檢測結果在上述兩組間無差異，均獲得150 bp的mRNA轉錄產物（圖5）。表明外源人類RAG-1的mRNA已成功表達于293T細胞。

圖5 轉染重組RAG-1編碼序列后RT-PCR檢測RAG-1 mRNA在293T細胞中的表達Fig.5 Expression of RAG-1 mRNA in 293T cells was detected by RT-PCR after transfection of recombinant RAG-1 coding sequence

2.2 RAG-2基因構建

2.2.1 RAG-2基因的克隆 從表達RAG-2的人類T細胞Total RNA中擴增的含有RAG-2編碼序列的RT-PCR產物為1 628 bp（圖6）。插入pMD19-TSimple Vector后，獲得攜帶RAG-2編碼序列的載體pMDhR2CS。

圖6 RAG-2 RT-PCR擴增產物Fig.6 RT-PCR products of RAG-2

2.2.2 RAG-2真核表達載體的構建及鑒定 用BamHⅠ和XbaⅠ將1 618 bp的目的基因片段從pMD-hR2CS切出后，插入真核細胞表達質粒pc-DNA3.1（+），獲得攜帶RAG-2編碼序列的真核表達載體phR2CS（圖7）。

圖7 RAG-2真核表達載體phR2CS結構示意圖Fig.7 Diagram of vector phR2CS for RAG-2 expression in eukaryotic cells

重組質粒phR2CS經BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測進行初步鑒定，得到1 618 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）載體片段，同預期的片段大小相符（圖8）。陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序部進行DNA測序。測序結果經BLAST軟件分析，與GenBank中人類RAG-2基因（Accession number：BC022397）完全相同（附圖2，www.immune99.com）。

圖8 重組質粒p MD-hR2CS的酶切鑒定Fig.8 Identification of recombinant plasmid p MD-hR2CS by restriction enzyme digestion

2.2.3 人類細胞中外源RAG2的表達 用重組質粒phR2CS轉染人源細胞株293T后，收獲孵育40 h的轉染體，提取Total RNA進行RT-PCR檢測。結果顯示，轉染細胞中可檢測到378 bp的人類RAG-2mRNA轉錄產物，而空質粒pcDNA3.1（+）轉染的空白對照未檢測到此產物（圖9）。看家基因GAPDH的RT-PCR檢測結果在上述兩組間無差別，均獲得150 bp的mRNA轉錄產物。表明外源人類RAG-2的mRNA已成功表達于293T細胞。

圖9 轉染重組RAG-2編碼序列后RT-PCR檢測RAG-2 mRNA在293T細胞中的表達Fig.9 RT-PCR was used to detect expression of RAG-2 mRNA in 293T cells after transfection of recombinant RAG-2 coding sequence

3 討論

RAG由一對位置相鄰、方向相對排列的RAG-1和RAG-2組成。其編碼產物RAG-1和RAG-2蛋白分子相互協同，特異性識別與免疫球蛋白（Ig）基因和T細胞受體（TCR）基因相鄰的重組信號序列（recombination signal sequence，RSS）在所募集的其他非特異性DNA酶的共同參與下，進行雙股DNA的切口、平端化及再連接，從而完成Ig和TCR的V（D）J基因重排。

獲得性免疫防御機制對不同抗原的特異性清除作用依賴與抗原特異性結合的多樣性的淋巴細胞組群的生成。淋巴細胞的多樣性是通過RAG對Ig基因和TCR基因的重組實現的。

RAG的表達是淋巴細胞及其分化發育階段特異性的。在執行淋巴細胞生成的中樞免疫器官胸腺和骨髓中，RAG的表達最為活躍。既往研究表明，RAG表達隨著淋巴細胞的分化發育形成兩次高峰。第一次高峰出現在祖-T（Pro-T）和祖-B（Pro-B）淋巴細胞階段，此時淋巴細胞正值Ig重鏈和TCR鏈基因的重排。第二次高峰出現在前-T（Pre-T）和前-B（Pre-B）淋巴細胞階段，與Ig輕鏈和TCR鏈基因重排有關。隨著淋巴細胞分化發育結束，RAG表達終止。RAG表達的階段性消長與淋巴細胞的分化發育過程密切的相關性亦表明其在功能性淋巴細胞生成中的關鍵作用。

本研究中，重組質粒phR1CS經BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測進行初步鑒定，得到3 209 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）載體片段，同預期的片段大小相符。對真核表達載體phR1CS進行DNA測序，測序結果經BLAST軟件分析與GenBank中人類RAG-1基因（Accession number：NM000448）完全相同；另一方面，重組質粒phR2CS經BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切檢測初步鑒定，得到1 618 bp的目的基因片段及5 366 bp的pcDNA3.1（+）載體片段，同預期的片段大小相符。對真核表達載體phR2CS進行DNA測序。測序結果經BLAST軟件分析，與GenBank中人類RAG-2基因（Accession number：NM000536）完全相同。

本實驗采用RT-PCR方法成功克隆了人類RAG-1編碼基因和人類RAG-2編碼基因，構建出RAG-1、RAG-2真核表達載體，并在轉染的人類細胞293T中獲得外源RAG-1、RAG-2的mRNA表達。為進一步探討有效、足量表達功能性RAGs分子的技術手段，從基因水平上根治RAGs免疫缺陷病奠定了基礎，其基因轉移操作不需要復雜設備和技術，便于應用，非常適合臨床治療的迫切需要，RAG1、RAG-2蛋白的表達功能活性將于后續報告闡述。