基于生物信息學分析PTX3基因在乳腺癌中的表達及臨床意義

趙雅雯，馬勇杰

（天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤細胞生物學實驗室，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津 300060）

乳腺癌在全球女性癌癥中的發病率為24.2%，位居女性癌癥的首位。在我國，乳腺癌發病率每年呈上升趨勢，每年有30余萬女性被診斷出乳腺癌[1]。早期乳腺癌被認為是可以被治愈的[2]。然而，仍有部分乳腺癌是無法治愈的，特別是晚期乳腺癌[3]。所以，探索乳腺癌相關標志物有利于其進行靶向治療，并且能夠更進一步的了解疾病發生、發展的分子機制。

五聚蛋白3（pentraxin 3，PTX3）是一種多聚糖蛋白，也是體液先天免疫的重要組成部分，全長共包含381個氨基酸。PTX3基因位于3號染色體上，由3個外顯子組成：第一個外顯子編碼信號肽，第二個外顯子編碼N端結構域，第三個外顯子編碼C端結構域；PTX3的啟動子含有多個轉錄因子結合位點，包括Pu1、核因子（NF）-κB、SP1、NF-白細胞介素（IL）6和激活蛋白（AP）-1[4-5]。PTX3表達是由幾種細胞類型的炎癥或微生物刺激誘導的，是對真菌、細菌和病毒來源的選定病原體的先天抵抗力的重要介質并參與炎癥、組織重塑和癌癥的調節[6]。有文章報道PTX3可介導乳腺癌細胞分化為BOLCs細胞和HA晶體的形成[7]。基于此證據，PTX3被認為是低分化型乳腺癌的新標志物[8]。然而，PTX3在乳腺癌發生、發展中的作用鮮有報道。本研究基于TIMER數據庫[9]、GEPIA2.0數據庫[10]、Kaplan-Meier Plotter數據庫[11]、UALCAN數據庫[12]、STRING數據庫[13]以及CancerSEA數據庫[14]進行數據挖掘，進而分析PTX3基因在乳腺癌中的表達情況及其預后意義，為后續研究PTX3基因在乳腺癌中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 在兩個數據庫中分析PTX3在乳腺癌中的表達情況TIMER數據庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）計算了來自32種癌癥類型的10 897份樣本。該數據庫提供了6個主要分析模塊，包括TIIC豐度與基因表達（gene），總生存期（survival），體細胞突變（mutation）和DNA體細胞拷貝數改變（SCNA）的關聯，以及差異基因表達（Diff Exp）和基因-基因相關性（correlation）[9]。本文通過此數據庫來分析不同癌癥類型和正常癌組織中PTX3 mRNA的表達情況，在Diff Exp的選項中輸入基因名PTX3并分析其在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的PTX3 mRNA的表達情況。

GEPIA2.0數據庫（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）是一個交互式網絡應用程序，對來自TCGA和GTEx數據庫的9 736個腫瘤和8 587個正常樣本進行基因表達分析，使用RNA測序數據的標準進行輸出[10]。本文從GEPIA2.0數據庫中獲得PTX3基因與正常組織的差異基因表達分析（DEGs），其中認為差異顯著的閾值為|log2FoldChange|>1.0，P<0.01。從而可分析得到PTX3 mRNA在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的的表達情況。

1.2 利用UALCAN數據庫分析PTX3的表達與臨床特征和預后的關系UALCAN數據庫（http://ualcan.path.uab.edu/）使用來自31種癌癥類型的TCGA RNA-seq數據和臨床數據進行檢索[12]。在基因名處輸入PTX3，在癌癥類型中選擇乳腺癌。然后分別對年齡、TNM分期、淋巴結轉移數以及TP53突變等臨床特征進行分組以及預后情況進行分析。

1.3 Kaplan-Meier Plotter繪圖儀數據庫分析PTX3 mRNA表達水平與乳腺癌患者預后的關系分析Kaplan-Meier Plotter繪圖儀數據庫（http://kmplot.com/analysis/）能夠評估30 000基因（mRNA，miRNA，蛋白質）的表達與來自21種腫瘤類型（包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌）的25 000個樣本存活率之間的相關性。數據庫的來源包括GEO、EGA和TCGA。本文運用此數據庫分析了PTX3 mRNA表達水平與乳腺癌患者預后的關系，所用探針ID為206157-at。為了對乳腺癌患者總體生存期和無進展生存期進行分析，自動選擇截止時間將患者樣本分為高表達和低表達兩組。總體生存期定義為從疾病確診日期到最后一次隨訪日期或患者死于乳腺癌的日期；無進展生存期定義為從開始用藥到乳腺癌患者最早出現局部復發、遠處轉移或者死亡的時間。運用COX回歸分析方法計算兩組病例之間的預后風險比（hazard ratio，HR）和95%置信區間，同時計算Log-rank P值，P<0.05為有統計學意義。并運用此方法分析PTX3 mRNA表達水平與各亞型乳腺癌患者總體生存期以及無進展生存期的關系。1.4利用STRING數據庫構建PTX3蛋白相互作用網絡STRING數據庫（https://cn.string-db.org/）用于構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡，目前在89個全測序基因組中包含261 033個同源基因[15]。本文通過該數據庫對PTX3蛋白相關的蛋白網絡進行分析。

1.5 利用CancerSEA數據庫分析PTX3在單個細胞里的功能相關性CancerSEA數據庫（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）描繪了一個癌癥單細胞功能狀態圖譜，其中包含25種癌癥類型的41 900個癌癥單細胞的14種功能狀態[包括干性、侵襲、轉移、增殖、上皮-間充質轉化（EMT）、血管生成、細胞凋亡、細胞周期、分化、DNA損傷、DNA修復、缺氧、炎癥和沉默][14]。本文則利用該數據庫分析PTX3基因在乳腺癌中的功能相關性。為后續實驗驗證奠定了基礎。

1.6 統計學處理 采用非參數Mann-Whitney檢驗分析比較基于TIMER和GEPIA2.0數據庫的PTX3 mRNA表達水平的差異；利用非參數Mann-Whitney檢驗分析比較PTX3在乳腺癌不同臨床亞組中的表達差異；利用Kaplan-Meier生存分析法判斷PTX3 mRNA表達水平與乳腺癌患者預后及不同亞型的乳腺癌患者預后的關系，采用Log-rank檢驗計算高低表達水平的生存差異得出P值。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 利用TIMER和GEPIA2.0兩大數據庫分析PTX3 mRNA在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的差異表達 本研究首先通過TIMER數據庫分析比較了PTX3 mRNA在正常乳腺組織（n=112）和乳腺癌組織（n=1 093）中的差異表達，結果顯示PTX3在乳腺癌組織中的表達明顯低于在正常乳腺組織中的表達（圖1A）。另外，本文還通過GEPIA2.0數據庫進行分析，分析結果顯示與TIMER數據庫所得到的結果一致，PTX3 mRNA在乳腺癌組織（n=1 085）中表達低于正常乳腺組織（n=291）（圖1B）。

圖1 TIMER數據庫和GEPIA2.0數據庫中PTX3 mRNA在浸潤性乳腺癌組織中和在正常乳腺組織中的表達情況Fig 1 Expression of PTX3 mRNA in invasive breast cancer tissue and normal breast tissue in TIMER database and GEPIA2.0 database

2.2 PTX3在乳腺癌不同臨床亞組中的表達情況 通過檢索UALCAN數據庫分析PTX3 mRNA在不同年齡亞組中的表達情況，將乳腺癌樣本按年齡分為4個組別與正常組織樣本進行比較，分別為：21～40歲（n=97）、41～60歲（n=505）、61～80歲（n=431）、81～100歲（n=54）。結果顯示PTX3 mRNA在正常組織中的表達明顯高于乳腺癌組織，其中，年齡為61～80歲的乳腺癌患者PTX3 mRNA的表達顯著低于41～60歲乳腺癌患者，其余年齡亞組組別無顯著差異（圖2A）；在腫瘤TNM分期方面，4期乳腺癌患者中的PTX3 mRNA表達低于1期和2期乳腺癌患者，3期乳腺癌患者的PTX3 mRNA的表達低于2期（圖2B）；在淋巴結轉移數分組方面，N2組和N3組PTX3 mRNA的表達均低于N0組（圖2C）；有TP53突變亞組比未突變亞組的PTX3表達量高且具有統計學意義（圖2D）。

圖2 PTX3在乳腺癌不同臨床亞組中的表達情況Fig 2 Expression of PTX3 in different clinical subgroups of breast cancer

2.3 利用Kaplan-Meier Plotter數據庫分析PTX3 mRNA表達水平與乳腺癌患者預后的關系

2.3.1 PTX3 mRNA表達水平與乳腺癌患者總人群預后的關系 為了進一步研究PTX3在乳腺癌中的預后價值，通過Kaplan-Meier Plotter數據庫分析發現，PTX3 mRNA高表達的乳腺癌患者的總體生存期（HR=0.80，95%CI：0.65～0.97，P=0.026）（圖3A）和無進展生存期（HR=0.89，95%CI：0.8～0.99，P=0.032）（圖3B）更長，且兩者與低表達組相比較均具有統計學意義。

圖3 PTX3 mRNA表達水平與乳腺癌患者總人群預后的關系Fig 3 The relationship between PTX3 mRNA expression level and prognosis of patients with breast cancer

2.3.2 PTX3 mRNA表達水平與各亞型乳腺癌患者預后總體生存期和無進展生存期的關系 為了進一步研究PTX3對不同亞型的乳腺癌患者的總生存期的影響，通過Kaplan-Meier Plotter數據庫進行分析，結果顯示在Luminal A型（HR=0.66，95%CI：0.48～0.92，P=0.013）（圖4A）以及基底樣型乳腺癌患者（HR=0.65，95%CI：0.44～0.94，P=0.023）（圖4D）中，PTX3 mRNA高表達的患者總體生存期更長。然而PTX3的表達水平并不影響Luminal B型（HR=0.72，95%CI：0.49～1.06，P=0.091）（圖4B）和Her2陽性型乳腺癌患者（HR=0.75，95%CI：0.42～1.32，P=0.31）（圖4C）的總體生存期。分析PTX3對不同亞型的乳腺癌患者的無進展生存期影響發現在Luminal A型（HR=0.78，95%CI：0.66～0.92，P=0.002 8）（圖5A），Luminal B型（HR=0.79，95%CI：0.66～0.94，P=0.007 6）（圖5B）以及基底樣型乳腺癌患者（HR=0.69，95%CI：0.55～0.87，P=0.001 2）（圖5D）中，PTX3 mRNA高表達的患者無進展生存期更長。然而在Her2陽性型乳腺癌患者（HR=1.29，95%CI：0.9～1.84，P=0.17）（圖5C）中則無此差異。

圖4 PTX3 mRNA表達水平與各亞型乳腺癌患者總體生存期的關系Fig 4 The relationship between PTX3 mRNA expression level and overall survival of patients with various subtypes of breast cancer

圖5 PTX3 mRNA表達水平與各亞型乳腺癌患者無復發生存期（RFS）的關系Fig 5 The relationship between PTX3 mRNA expression level and recurrence free survival（RFS）of patients with various subtypes of breast cancer

2.4 PTX3蛋白相互作用網絡通過STRING數據庫分析 得到具有11個節點數的PTX3蛋白互作網絡，其中與PTX3相互作用的蛋白（score>0.9）包 括FGF2、FCN1、CFH、FCN2、TNFAIP6、SELP、MBL2、C1QA、CFHR1等（圖6），其富集條件為3.8e-07。

圖6 PTX3在乳腺癌中的蛋白質-蛋白質相互作用網絡Fig 6 Protein-protein interaction network of PTX3 in breast cancer

2.5 PTX3在單個細胞里的功能相關性分析CancerSEA數據庫的功能相關性分析表明，在單個乳腺癌細胞中PTX3基因表達與乳腺癌功能狀態的相關性進行分析，PTX3基因的表達與炎癥呈顯著正相關（r=0.74，P<0.001），與轉移、干細胞特性、組織缺氧呈顯著負相關（r=-0.42、-0.4、-0.32，P均<0.001）（圖7）。

圖7 PTX3基因表達與乳腺癌細胞功能狀態的相關性Fig 7 Correlation between PTX3 gene expression and functional status of breast cancer cell

3 討論

乳腺癌是全世界女性中最常見的癌癥之一。在發展中國家，乳腺癌的發病率持續增加，許多病例直到晚期才被診斷出來[16]。盡管輔助化療和激素藥物的使用已經改善了乳腺癌的死亡率，但是也有部分患者未能從中獲益。因此尋找早期診斷和治療乳腺癌的靶點基因對改善患者生存率至關重要。

本研究基于TIMER和GEPIA2.0數據庫分析發現，PTX3 mRNA在乳腺癌組織中的表達低于乳腺正常組織。通過UALCAN數據庫分析PTX3 mRNA與乳腺癌患者臨床特征的關系發現，PTX3 mRNA表達水平與年齡、TNM分期、淋巴結轉移數和TP53突變有關。為了進一步了解PTX3如何參與乳腺癌的發生和發展，通過Kaplan-Meier Plotter數據庫分析PTX3 mRNA的表達水平與乳腺癌預后關系顯示，PTX3 mRNA高表達的乳腺癌患者的總體生存期和無進展生存期更長，提示PTX3可能作為抑癌因子在乳腺癌中發揮作用。有報道稱，在3-甲基膽蒽（3-MCA）誘導的以及7，12-二甲基苯并[α]蒽/對苯二甲酸（DMBA/TPA）誘導的皮膚癌小鼠模型中，PTX3缺失導致間充質細胞和上皮細胞致癌的易感性增加。在此模型中，浸潤的白細胞，特別是單核-巨噬細胞和內皮細胞是PTX3對局部產生的IL-1的主要來源，兩者都有助于PTX3依賴的抗癌作用。PTX3缺失與巨噬細胞腫瘤浸潤增強、促炎細胞因子產生、血管生成、補體關鍵成分（C3和C5a受體）表達水平有關，導致腫瘤相關炎癥的加劇，而PTX3對腫瘤細胞增殖無直接影響[17]。因此，PTX3在癌癥相關炎癥（CRI）中可作為外源性的腫瘤抑制因子基因，通過調節補體級聯反應抑制CRI[18]。另有研究表明PTX3可抑制膀胱癌的細胞增殖、運動、代謝和干性[19]。以上數據表明PTX3可能在抑制腫瘤進展中發揮作用。

為了后續更進一步了解PTX3在乳腺癌中的生物學功能及其調控網絡，本文又利用STRING蛋白相互作用網絡和CancerSEA數據庫從兩個不同方面分析了PTX3蛋白在乳腺癌中可能發揮的功能，兩個數據庫同時顯示此蛋白在乳腺癌發生、發展中可能是通過炎癥信號道路來抑制乳腺癌的進展。眾所周知，炎癥參與某些疾病的病理生理學，是癌癥發展和發病機制的標志性特征[20]。炎癥信號通路通常為NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Janus激酶-信號轉導與轉化激活蛋白（JAK-STAT）通路[21]。有研究發現PTX3可作為NF-κB/p65調控的目標分子，利用I-кB激酶抑制劑IKK-16抑制PTX3表達從而抑制p65，導致肺癌細胞的遷移和侵襲能力減弱[22]。另有研究證明，在胃癌中，細胞因子腫瘤壞死因子（TNF）-α通過下調PTX3促進胃癌的侵襲、轉移和EMT，表明PTX3與細胞因子之間存在潛在聯系[23]。以上數據與筆者預測結果一致。另外，PTX3與成纖維細胞生長因子-2（FGF2）/FGF受體（FGFR）系統相互作用，并通過其N端結構域抑制EMT，從而抑制黑色素瘤[24]、乳腺癌[25]、前列腺癌[26]和多發性骨髓瘤[27]的腫瘤轉移、腫瘤生長和腫瘤血管生成[23]。綜上所述，PTX3可能通過調控炎癥信號通路、細胞因子或與FGF2的相互作用，抑制乳腺癌的發生、發展。然而，PTX3具體在乳腺癌中是如何發揮抑癌作用的有待進一步驗證。

總之，本研究利用生物信息學分析手段對乳腺癌進行分析發現PTX3在乳腺癌組織中低表達并與TNM分期、淋巴結轉移等相關，且高表達患者預后較好。此為臨床基因治療提供了理論基礎。在功能方面，PTX3蛋白主要參與炎癥且呈正相關，與轉移、干細胞特性、組織缺氧呈顯著負相關。這為進一步研究PTX3基因在乳腺癌中的作用和分子機制提供了依據和線索。