嗜酸細胞浸潤食管固有肌層誘導小鼠賁門失弛緩癥樣食管運動障礙

張凌云，趙威

（天津醫科大學總醫院消化科，天津 300052）

賁門失弛緩癥（AC）是一種罕見的食管運動障礙性疾病，表現為體重減輕、吞咽困難、反流和胸痛。雖然發病率低，但是患病率并不低，賁門失弛緩癥嚴重影響患者的生活質量[1]。它的發病機制至今仍然未知，目前現有的治療方式如腹腔鏡heller肌切開術（LHM）、球囊擴張術（PD）或經口內鏡肌切開術（POEM）等都只能控制癥狀，而不能治愈疾病。雖短期效果好，但長期效果不理想，復發率高[2-3]。這使得研究AC的發病機制至關重要。

免疫介導的神經節炎可能誘發AC的食管肌層神經元損傷，包括嗜酸性粒細胞在內的各種炎癥細胞參與了這一過程[4-6]。筆者還在AC患者POEM期間采集的肌肉標本中發現了食管固有肌層嗜酸性粒細胞浸潤，并與神經節炎和肌神經元損傷有關[7]。由于嗜酸細胞釋放的物質，如嗜酸細胞陽離子蛋白（ECP）和嗜酸細胞源性神經毒素（EDN）可損傷神經[8]，而POEM前食管肌層內的嗜酸細胞浸潤與治療后預后不良有關[7]。筆者推測，食管平滑肌中的嗜酸性粒細胞浸潤可能與AC的發病機制有密切的關系。然而，缺乏食管固有肌層嗜酸細胞浸潤的動物模型是進一步研究的主要障礙。

在本研究中，筆者借鑒嗜酸性粒細胞食管炎（EoE）動物模型的方法制作了嗜酸性粒細胞浸潤食管肌層的AC模型。此外，筆者還研究了抗原暴露時間與食管壁嗜酸粒細胞浸潤程度、食管肌層神經元的喪失以及食管運動異常之間的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料BALB/c小鼠50只，雌雄各半，約4～6周齡。均由北京維多利亞實驗動物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 分組 適應性喂養1周后，使用抽簽法將小鼠隨機分為兩組：對照組（n=20）和模型組（n=30）。分別在每個時間點（0 d、21 d、28 d）比較兩組的體重、食管下括約肌壓力（LESP）、食管寬度和食管排空情況。食管壁的嗜酸細胞數量和食管固有肌層神經元的數量也分別在基線和終點進行了組間比較。此外，還比較了模型組在每個時間點的食管運動和組織學參數。在模型組，在每個時間點，使用抽簽法隨機選擇10只小鼠處死后進行食管病理檢查。而在對照組中，也分別在基線和終點隨機選擇10只小鼠進行同樣的檢查。

1.2.2 模型構建 用3%的異氟烷吸入法對小鼠進行輕度麻醉，并腹腔注射含50 μg卵清蛋白（Sigma，美國）和1 mg明礬（Sigma，美國）的PBS溶液（50 μg/1.0 mg/0.5 mL），兩次間隔14 d。從第15天開始，在吸入10%異氟烷麻醉的情況下，用微吸管向小鼠鼻內注射150 μg卵白蛋白（OVA）。上述操作每周進行3次，持續2周。除最后1次外，每次手術后1 h給予小鼠正常的飲用水和飲食。而對照組則給予與模型組相同體積的PBS溶液。

1.2.3 食管測壓 吸入麻醉后，使用水灌注壓力測量系統（MMS，荷蘭）進行測壓。記錄小鼠的LESP。

1.2.4 食管排空 小鼠保持仰臥位，將0.1 mL碘海醇注入食管內。X光透視下最寬處為食管的寬度。然后，將另一個帶改良針頭的灌胃針將標記物（直徑1 mm的不銹鋼球，運城縣康達鋼球有限公司）從針尖釋放到食管的胸骨角水平處。通過X射線透視并記錄標記物通過食管的整個過程。標記物從胸骨角水平到賁門水平和通過賁門的時間分別被記錄為食管通過時間和賁門通過時間。

1.2.5 組織學分析 將LES部位組織進行固定包埋，制成5 μm的切片，進行HE及免疫組化染色。對主要堿性蛋白（MBP）、嗜酸細胞陽離子蛋白（ECP）和SOX-10進行免疫組化染色，以分別識別活化的嗜酸性粒細胞和食管肌層神經元。

1.2.6 免疫組織化學評價 在光鏡下進行免疫組化染色的半定量分析，通過免疫組織化學評分（IHS）進行評估。IHS的計算方法是將數量評分（1%～10%為1，11%～50%為2，51%～80%為3，81%～100%為4）與染色強度評分（0=陰性，1=弱，2=中等，3=強）相乘。IHS的范圍從0到12。9～12分的IHS被認為是強免疫反應性，5～8分是中度，1～4分是弱，0分是陰性。

1.3 統計學處理 使用用SPSS 22.0進行分析。符合正態分布的計量資料以±s表示。組間和模型組內的比較酌情使用非配對t檢驗或Mann-Whitney U檢驗進行分析。嗜酸細胞計數與食管肌層神經元之間的相關性用Spearman等級相關進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠的一般狀況和體重 模型組小鼠從第21天攝取的食物量顯著減少，并表現出活動減少和毛發豎立等癥狀。隨著OVA刺激時間的延長，模型組小鼠體重低于對照組，實驗結束時（第28天，t=-2.569，P=0.019）差異有統計學意義（圖1）。

圖1 不同時間節點的體重Fig 1 The body weight at different time points

2.2 小鼠的LESP與對照組相比，模型組小鼠在基線和第21天時LESP無統計學差異，而在第28天時，模型組LESP比對照組高（t=2.187，P=0.042）。同時，模型組隨著OVA刺激時間的延長，與基線狀態相比，LESP在28 d時增高（t=3.082，P=0.004），見圖2。

圖2 不同時間節點的LESPFig 2 The LESP during different time points

2.3 食道排空和食道放射檢查 與對照組相比，模型組的食管通過時間在第21天（t=2.540，P=0.017）和第28天（t=3.993，P=0.001）時明顯延長，賁門通過時間在第28天時明顯延長（t=2.168，P=0.044），食管寬度無顯著差異。隨著OVA刺激時間的延長，與基線狀態相比，模型組在第21天（t=5.429，P<0.000 1）、第28天（t=7.149，P<0.000 1）時食管通過時間明顯延長，在第28天時，賁門通過時間明顯延長（t=2.227，P=0.032），而食管寬度在整個實驗過程中無明顯差異（圖3）。

圖3 食管排空和X線放射檢查Fig 3 Esophageal emptying test and esophageal radiography

2.4 小鼠食管的組織病理學HE染色 兩組在基線時食管內幾乎沒有嗜酸性粒細胞。實驗結束時，模型組固有肌層（t=4.587，P<0.000 1）和黏膜層（t=8.417，P<0.000 1）的嗜酸性粒細胞數量均超過對照組。此外，模型組隨著OVA刺激的延長，食管固有肌層第28天時（t=4.429，P=0.000 3）嗜酸性粒細胞較基線增加，黏膜層第21天（t=5.219，P<0.000 1）和第28天（t=4.623，P=0.000 2）較基線增多（圖4、5）。

圖4 食管組織中嗜酸性粒細胞數量Fig 4 Number of eosinophils in esophageal tissue

免疫組化染色發現，模型組食管肌層MBP陽性嗜酸性粒細胞散在或局灶分布，并伴有散在的ECP和EDN陽性顆粒。相反，在對照組中未觀察到MBP、ECP和EDN的表達（圖5）。

圖5 第28天時對照組和模型組小鼠食管組織的嗜酸性粒細胞、神經細胞的免疫組織化學染色（400×）Fig 5 Immunohistochemical staining of the esophageal tissue for eosinophils，and nerve cells of mice in control and model group at D28（400×）

2.5 SOX-10顯示的肌層神經元 基線時，兩組無差異，第28天時，模型組肌層神經元減少（t=-4.283，P<0.000 1）。隨著OVA暴露時間的延長，與基線相比，模型組的肌間神經元在第28天時（t=-4.328，P=0.000 4）明顯減少（圖6）。

圖6 SOX-10顯示的肌間神經元Fig 6 Myenteric neurons indicated by Sox-10

2.6 肌層嗜酸性粒細胞浸潤與肌間神經元的相關性 食管平滑肌層嗜酸性粒細胞的數量與Sox-10表達所表明的肌間神經元呈負相關（r=0.531）（圖7）。

圖7 肌層嗜酸性粒細胞浸潤與肌間神經元的相關性Fig 7 The correlation between eosinophil infiltration and the myenteric neurons

3 討論

在建立EoE動物模型的各種方法中[9-12]，呼吸道抗原，如卵清蛋白（OVA），操作簡單，成本低，易于控制實驗條件[13]。然而，在上述小鼠模型中[9，12-13]，嗜酸粒細胞浸潤的深度主要在食管鱗狀上皮、黏膜肌層和黏膜下層，這與以往AC的病理發現不一致。與傳統的EoE小鼠模型相比，在致敏小鼠中，較長時間的呼吸道抗原暴露可誘發食管固有肌層的嗜酸細胞浸潤、食管固有肌層神經元的喪失和AC樣食管運動障礙。

在研究結束時，小鼠食管固有肌層出現嗜酸性粒細胞浸潤，并出現類似AC的食管異常運動。此外，食管肌層中嗜酸性粒細胞的增加與食管神經元的減少呈正相關。由于X射線沒有發現食管狹窄，因此可以合理推測，食管肌層中的嗜酸細胞浸潤可能誘發神經元的減少和AC樣食管運動障礙。這可能與嗜酸細胞分泌物釋放，LES蠕動和松弛障礙，或細胞毒性嗜酸性粒細胞分泌物的釋放，如ECP和EDN[8]有關。在本研究中，ECP和EDN均由免疫組化證實，支持該假設。今后，有必要在小鼠模型中進一步探討相關的細胞毒性物質。

也有研究表明，OVA也可以誘導肥大細胞在食管壁的浸潤[14]。Mavi等[15]發現，在一個跨基因的EoE小鼠模型中，食管運動功能障礙是由于肥大細胞炎癥。但在以前的研究中，食管固有肌層中嗜酸細胞和肥大細胞的浸潤程度以及肌層神經元的數量都未得到明確的體現。因此，以前的研究結果不能作為排除本研究中由嗜酸細胞浸潤引起的AC樣食管運動障礙的可能性的證據。

嗜酸性粒細胞和肥大細胞都可以在AC患者的食管固有肌層標本中發現[5，7，16]。除了上述不一致的證據外，一個臨床證據甚至認為，由于食管運動的改善和嗜酸細胞浸潤的減少，對AC使用潑尼松龍會導致吞咽困難的完全消失[17]。迄今為止，仍不清楚哪些炎癥細胞對AC的發生貢獻最大。在這個問題上，這種OVA誘導的小鼠模型具有類似AC的食管組織學和功能特征，為今后的研究提供了一個合適的平臺。

嗜酸粒細胞浸潤食道的深度與呼吸道抗原的類型和接觸時間有關。簡單的呼吸道過敏原（如狗、貓、蟑螂、塵螨和A.fumigatus）刺激，持續21～28 d，可以促進嗜酸細胞主要在上皮細胞中浸潤[10，18]。然而，如果通過腹腔注射OVA使小鼠致敏，然后通過呼吸道接觸OVA 14 d，可以發現嗜酸細胞浸潤的趨勢更深，大部分嗜酸細胞浸潤到黏膜和黏膜下層[19]。為了支持以前的研究結果，筆者還觀察了從21 d開始食管黏膜和黏膜下層的嗜酸細胞浸潤情況。正如預期的那樣，與黏膜中的嗜酸細胞相比，在OVA刺激的后期，嗜酸細胞出現在食管肌層中，表明長時間的OVA治療有利于食管壁中嗜酸細胞浸潤的加深。這可能是由于第一次致敏促進了特異性T和B細胞反應，以及隨后的過敏性發展[19]。

筆者還發現食管壁中嗜酸細胞的數量隨著OVA暴露時間的延長而增加。然而，與以前的研究相反，本研究中的增加曲線不是已往的“S”形或倒“V”形[18，20]，而是線性的。這可能與所采用的方案不同有關，也可能與本研究中治療時間不夠長以達到嗜酸性粒細胞的峰值有關。為了弄清嗜酸細胞浸潤的動力學，今后應進一步延長OVA治療時間，同時增加停藥觀察期。

當然，筆者的研究也有局限性。雖然食管肌層的嗜酸細胞浸潤比較突出，但不能排除同一部位有其他炎癥細胞浸潤的可能性。作為食管固有肌層嗜酸性粒細胞浸潤的小鼠模型，雖然符合AC的功能和病理特征，但也可能是嗜酸細胞性食管肌炎（EoEM），與AC有一定程度的區別[21-22]。盡管如此，這是唯一一項專門研究固有肌層中的嗜酸細胞浸潤以及它與小鼠食管肌層神經元和食管運動關系的研究。

綜上所述，本研究表明，長期OVA刺激可能誘發食管固有肌層的嗜酸細胞浸潤、肌層神經元的喪失和食管的AC樣運動障礙。雖然還需要進一步驗證，但本研究討論的方法有助于探索嗜酸細胞浸潤與AC之間的關系，甚至有助于未來相應的治療方案。