福爾馬林固定標本DNA提取及富集實驗方法優化

余金慧，馬文文，陳 欣，湯永濤，周傳江＊

（河南師范大學水產學院，河南新鄉 453007）

目前，由于十年禁漁，魚類資源在部分水域銳減，對于瀕危且資源量稀少的魚類進行資源調查存在諸多困難，同時基于DNA和eDNA在魚類分類鑒定方面的迅猛發展[1]，對瀕危物種的資源檢測日益重要，從館藏標本中獲取基因信息成為有效補充途徑，但對于福爾馬林標本中提取目的基因片段的相關報道較少[2-6]，因此提取館藏福爾馬林保存瀕危魚類的DNA，并獲得保護魚類有效的eDNA引物，對于有效獲取水體中魚類時空分布和資源量信息具有積極推動作用。福爾馬林保存樣品中獲得的DNA在生物進化、系統發育、保護瀕危物種以及研究種群遺傳學中也具有重要意義[7-8]。

福爾馬林是一種保存標本常用防腐劑，但在長期保存條件下，隨著保存時間的延長，提取的DNA質量會逐漸下降。近期研究表明，福爾馬林并未破環DNA的分子結構，DNA仍完整地存在于組織中，僅僅造成基因與基因、蛋白質與蛋白質、基因與蛋白質之間發生交聯作用[5]，需要用緩沖液長時間的進行浸泡和置換[9]。提取DNA的結果也受到多方面因素的影響，實驗過程中樣本的大小和采樣部位都會影響提取DNA的質量[8]和獲得量，保存標本過程中的溫度也會影響DNA保存的效果。原位雜交實驗也顯示DNA并沒有由于福爾馬林的長期浸泡而被消解，只是造成DNA發生交聯作用難以獲得[9]。由于實驗方法、標本保存環境和條件的不同，解交聯的效果不同，難以保證基因與蛋白質之間的交聯被完全解開，所獲得的基因會發生片段化，因此本研究先從短片段提取和擴增開始進行實驗探索。

現有福爾馬林保存標本提取及富集DNA的實驗中，實驗材料保存時間多在1年以下，因此根據之前的實驗方法對提取及富集DNA的步驟做了以下幾方面的優化[10-14]：通過增加緩沖液置換的時間，并在此期間進行適當的加熱；增加蛋白酶K、DTT、SDS等的用量；減少DNA的凍融次數和時間；擴增過程中適當提高退火溫度等方法，經過多方組合優化后均可顯著提高實驗的成功率（DNA含量和擴增片段的長度）。具體優化后實驗方法報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

實驗材料：兩尾九十年代福爾馬林保存的北方銅魚標本（分別用1、2表示）；采用長江流域酒精保存的銅魚；一對基于銅魚（Coreius heterodon，登錄號：NC020042、JF906110）、圓口銅魚（Coreius guichenoti，登錄號：NC020041、JF906108）利用BioEdit軟件自行設計的線粒體DNA細胞色素b引物Cytb-1。

表1 銅魚屬DNA Cytb-1擴增引物及反應條件

實驗試劑：1×GTE溶液（100mmoL/L氨基乙酸、10mmoL/L Tris-HCL、1mmoL/L EDTA）；DTT（二硫蘇糖醇）；SDS（十二烷基磺酸鈉）；蛋白酶K；NH4Ac（醋酸銨）；ddH2O。

1.2 實驗方法

經過對比現有已報道方法并結合提取效果，總結為以下優化后的實驗方法。以越南鱊、興凱鱊作為外類群，使用Phylosuite軟件[15]基于貝葉斯信息標準（BIC），每1000代取樣一次，運行結束后，丟棄25%的樣本，對剩余的抽樣樹進行整合，構建50%的一致樹，使用后驗概率值（PP）作為節點支持率，構建北方銅魚的系統發育樹，以證實本實驗方法的可行性、準確性。

1.2.1 DNA的提取

用剪刀、鑷子選取固定形態、保存狀況良好的福爾馬林標本，取2g的肌肉組織、背鰭鰭條、鰓蓋邊緣；將組織放入1.5mL的離心管中，加入1mL1×GTE緩沖液，水浴鍋60℃孵育7d，每12h換一次緩沖溶液，消化過程中進行適當的震蕩；吸取GTE溶液，室溫干燥；加入500μLGTE溶液95℃，水浴加熱15min，室溫冷卻5min，吸去GTE溶液；加入100μL蛋白酶K、50μL SDS、50μL DTT，60℃水浴加熱24h；若溶液仍為渾濁狀態，應再添加蛋白酶K、DTT，在此過程中可添加較多的DTT，以提高提取效率；冷卻至室溫；加入500μL苯酚，均勻混合，離心機10000r/min，離心10min，保留上清液。重復3次；加入相當于上清液2.5倍體積的無水乙醇，0.5倍體積的NH4Ac，放入-20℃保存24h；離心機6000r/min，離心10min，保留沉淀；室溫干燥5h；加入40μL ddH2O溶解即得到DNA提取液。

1.2.2 DNA的擴增

10μl體系擴增，選擇北方銅魚的目的基因（PCR擴增的模板）、引物Cytb-1、引物Cytb-2、Mix酶、ddH2O，PCR擴增如下：預變性選擇94℃，5min；變性94℃，40s；復性選擇53℃，40s；延伸選擇72℃，80s；共35個循環；72℃，10min；最后12℃停止。

第一次PCR擴增產物的產量不足，不能達到測序要求，為此，本文使用二次PCR進一步富集。二次PCR的方法為第一次PCR擴增產物作為二次PCR擴增的模板，其他步驟與第一次PCR相同。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

PCR擴增結束后立即進行凝膠電泳制備1%瓊脂糖凝膠，點樣、電泳。凝膠成像如圖1所示：

圖1 Cytb-1引物二次PCR產物電泳圖

1.2.4 系統發育分析

本研究選擇北方銅魚（Coreius septentrionalis）、銅魚（Coreius heterodon）棒花魚（Abbottina rivularis）各1條Cytb基因序列，圓口銅魚（Coreius guichenoti）和麥穗魚（Pseudorasbora parva）各2條Cytb基因序列，根據最佳分區模型和最適核苷酸替代模型，構建貝葉斯樹（MrBayes）。結果如圖2所示。

圖2 基于Cytb基因的貝葉斯法（MrBayes）系統發育樹。節點上的數字是MrBayes的支持率，物種名稱后面的數字是GenBank登錄號。圖中顯示了外類群，北方銅魚（Coreius septentrionalis）加粗放大。

2 結果及分析

結果顯示提取銅魚（酒精保存）的DNA濃度平均值為245.7ng/μL，提取北方銅魚（福爾馬林保存）的DNA濃度平均值為485.5ng/μL，A260/280=1.57～1.80?？梢钥闯龃藢嶒灧椒梢蕴崛NA片段，其中可能存在蛋白質、碳水化合物等因素的影響。

圖1是Cytb-1引物二次PCR的電泳圖，設計的目的條帶為204bp，電泳條帶與目的條帶長度在同一范圍內，且通過測序成功得到目的條帶的基因序列。但由于在擴增過程中為了避免模板濃度低、電泳過程中目的條帶不明顯，實驗中引物量略多，在電泳圖中可以看到引物二聚體?？筛鶕嶒炦m當減少引物用量，以進行二次PCR。圖2表示依據Cytb基因序列構建系統發育樹，結果顯示北方銅魚與銅魚、圓口銅魚親緣關系最近，且銅魚屬成為單系群，越南鱊和興凱鱊位于系統發育樹基部位置?？梢宰C實實驗方法的可行性和準確性。

3 結論與展望

使用此方法已成功提取出北方銅魚的Cytb基因片段，所獲得的基因最大片段在400bp左右，但實驗周期較長。根據實驗研究發現，提取的質量和測序的成功率隨保存時間增加而降低[16-17]。根據夏穎哲等實驗方法，可以得到長片段的DNA，但是實驗過程中并未獲得長片段的基因，因此推測可能是以下原因：

（1）基因與基因、蛋白質與蛋白質、基因與蛋白質之間確實存在交聯作用[5]，導致DNA難以提取。我們在實驗中未能成功獲得大片段基因，可能是由于不同標本保存時間、狀態以及保存過程中環境條件的不同[8]，實驗試劑、設備的不同等原因導致提取DNA的效果不盡相同?？筛鶕陨韺嶒灄l件、實驗對象保存情況對實驗方法進行優化，提取甲醛標本基因片段的實驗仍需要進行改進和優化，以進一步提高解交聯的效果。

（2）也可能基因與基因、蛋白質與蛋白質、基因與蛋白質之間并不存在解交聯的過程，館藏樣品組織中的基因組確實受到福爾馬林長期作用的影響發生片段化，而提取過程的處理使其基因發生片段化加劇。

導致福爾馬林保藏標本提取基因片段困難的原因未能獲得一致認可，基因與基因、蛋白質與蛋白質、基因與蛋白質之間存在的交聯作用使提取基因片段效果不佳的結論，還需要進一步進行科學研究和探索。