鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ與心力衰竭關系的研究進展

曹亞選，鄭榮菲，王 賀

心力衰竭是幾乎所有心血管疾病的終末階段，嚴重威脅著人類的健康。雖然近年來心力衰竭的治療進展明顯，但是心力衰竭病人的預后仍然不容樂觀，其5年生存率僅為50%左右[1]。無論是發展中國家還是發達國家，心力衰竭都有很高的發病率、死亡率和醫療費用占比[2]。我國一項針對心力衰竭進行的抽樣調查結果顯示，隨著年齡增加，心力衰竭患病率逐年上升[3]。研究證實，鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是將神經體液刺激與心臟重構關聯的重要介質，心臟疾病早期即伴隨CaMKⅡ活性升高，而晚期或終末期心力衰竭病人CaMKⅡ表達明顯上調[4]。CaMKⅡ的表達和活性增加被證明在調節心肌細胞死亡中起著核心作用。因此，抑制CaMKⅡ活性也被認為可能是治療心力衰竭新的靶點?，F綜述近年來CaMKⅡ在心力衰竭過程中作用機制的相關進展，為心力衰竭的研究和治療提供依據。

1 CaMKⅡ的分布

鈣離子/鈣調蛋白依賴性激酶(CaMK)是一類對細胞內鈣離子變化做出反應的多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要由3個成員組成：CaMKⅠ、CaMKⅡ和CaMKⅣ。CaMKⅡ是由2個六聚體環堆疊而成的十二聚體結構，具有廣泛的組織分布。研究發現CaMKⅡ存在4種異構體(α、β、δ、γ)，每種異構體都由一個單獨的基因編碼。不同組織中異構體的分布也不相同，其中，α和β異構體在腦中高度表達，而心臟中表達的主要異構體是δ以及較少量的γ[5]。CaMKⅡδ已經被證明是影響心力衰竭發生發展的關鍵。CaMKⅡδ在體內可產生多種不同的剪接變體，然而目前尚不能確定哪種CaMKⅡδ剪接變體在CaMKⅡ介導的心臟病中起主要作用。

2 CaMKⅡ的激活

每個CaMKⅡ單體包括N-末端催化結構域、調節域和C-末端結合結構域3個主要結構。在CaMKⅡ的非活性狀態下，催化結構域被調節域空間阻斷，這種模式也被稱為自抑制狀態。隨著細胞內鈣離子濃度的升高，鈣離子與鈣調蛋白(CaM)結合，鈣化的CaM與CaMKⅡ調節域中的鈣離子/CaM結合位點結合并激活CaMKⅡ，導致CaMKⅡ構象發生變化，暴露出催化結構域的激酶底物和三磷酸腺苷(ATP)結合位點，允許底物和ATP進入催化域。即使在鈣離子/CaM復合物解離后，自動磷酸化也賦予CaMKⅡ自主激酶活性，從而防止催化結構域與自抑制結構域的重新結合[6]。事實上，除了通過鈣離子/CaM結合的典型激活方式，CaMKⅡ活性還受到許多翻譯后修飾的調節，包括活性氧(ROS)氧化、一氧化氮(NO)依賴的S-亞硝基化、高血糖期間的O-GlcN?；约巴ㄟ^未完全分解的環磷酸腺苷(cAMP)-環磷酸腺苷交換蛋白(EPAC)-一氧化氮合酶(NOS)途徑[7]。激活后的CaMKⅡδ可影響許多參與心肌鈣循環的蛋白，如L型鈣通道、蘭尼定受體、肌漿網鈣ATP酶和磷蛋白。這些蛋白涉及了心臟的興奮-收縮偶聯、心肌細胞凋亡、心肌肥大、炎癥和心律失常相關基因的轉錄激活。

3 CaMKⅡ在心力衰竭中的作用

心力衰竭是臨床上常見的心血管疾病，這種疾病導致心臟功能受損，顯著增加病人住院和死亡風險。心力衰竭發生發展的基本機制是心肌重構，其核心在于心肌細胞鈣穩態平衡紊亂，進而導致心肌舒縮功能受損。在心力衰竭代償期，機體交感神經興奮性增強和腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活，通過水鈉潴留、外周血管收縮及增強心肌收縮力，維持正常的心臟輸出。在代償過程中，心肌細胞、胞外基質等均發生變化，出現心腔擴大、心肌肥厚現象。隨著時間的延長，這些神經體液代償機制最終也將產生直接心肌細胞毒性，引起心肌纖維化，促進心臟重塑，促使心肌細胞凋亡，加重心功能惡化，最終失代償導致不可逆轉的終末階段。心室重構是心力衰竭發生發展的核心病變，對其機制研究將大大提升臨床心力衰竭的防治水平。心肌重構的機制是復雜的，包括鈣離子超載、心肌肥厚、線粒體功能障礙、心肌細胞死亡等，近年研究發現CaMKⅡ對這些過程都會產生影響。

3.1 鈣離子超載 研究發現無論是擴張型心肌病心力衰竭病人還是缺血型心肌病心力衰竭病人CaMKⅡδ活性都明顯增加。CaMKⅡ活性增強，通過對心臟2型蘭尼定受體通道(RyR2)過度磷酸化，增加舒張期肌漿網(SR)鈣離子泄漏。CaMKⅡ依賴性舒張期肌漿網鈣離子漏出增加是心室肌衰竭的標志，是心力衰竭時肌漿網鈣耗竭和收縮功能障礙的基礎。此外，鈣離子穩態失調會導致不良適應應激反應的擾動和心律失常事件的發生，從而進一步加重心力衰竭。

3.2 心肌肥厚 交感神經興奮性增強和腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活過程中均存在CaMKⅡ被激活的現象，并對心力衰竭病理發展產生重要的作用。β-腎上腺素能受體過度激活導致病理性心臟重塑和心肌肥厚的現象與活化的CaMKⅡ密切相關[8]。使用基因手段抑制CaMKⅡ的表達，便可以抑制異丙腎上腺素所引起的心肌肥厚，并明顯改善壓力負荷心肌肥厚小鼠的心肌收縮和舒張功能[9]。研究發現，CaMKⅡ能夠通過調控組蛋白脫乙?；?HDAC)的磷酸化，進而影響腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)的表達與心肌纖維化，從而參與肥大基因的轉錄調控。在血管緊張素Ⅱ作用于大鼠胚胎心肌細胞株H9c2細胞，建立體外心肌細胞肥大模型的研究中發現，在CaMKⅡ水平增加的同時，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化水平也隨之增加。使用CaMKⅡ抑制劑與血管緊張素Ⅱ共處理H9c2細胞發現KN-62在抑制CaMKⅡ磷酸化的同時，顯著地抑制了血管緊張素Ⅱ誘導的AMPK磷酸化。表明在心肌肥大調控網絡中，CaMKⅡ作為AMPK的上游調控因子，可以通過調控AMPK信號通路來調控細胞自噬，進而調節心肌肥大的發生發展[10]。

3.3 線粒體功能障礙 線粒體作為心肌細胞中重要的細胞器，是參與心室重構的重要環節，線粒體功能障礙同樣是心力衰竭發展過程中的一個重要事件。研究表明，死亡細胞因子如TNF-α觸發一種“程序性”形式的壞死，這種壞死可由受體相互作用蛋白3(RIP3)激活引發[11]。研究發現，CaMKⅡ是一種新的RIP3底物，RIP3通過磷酸化或氧化誘導CaMKⅡ的激活，進而通過增加線粒體內膜鈣單向轉運體電流(IMCU)影響線粒體通透性轉換孔(MPTP)的開放，導致線粒體內膜去極化并最終導致細胞死亡。因此，RIP3-CaMKⅡ-MPTP途徑有望成為治療心肌損傷和心力衰竭的靶點[12]。

3.4 細胞壞死 心肌細胞壞死也是失代償發生的一個重要因素，心肌細胞的減少使心肌整體收縮力降低。研究表明，不同的CaMKⅡδ剪接變體對凋亡過程有著不同的影響，位于細胞質中的CaMKⅡδ2(又稱CaMKⅡδC)有促凋亡特性，而位于細胞核中的CaMKⅡδ3(又稱CaMKⅡδB)具有抗凋亡特性[13]。另有最新研究發現CaMKⅡδ9，人類心臟中含量最豐富的CaMKⅡδ剪接變體，通過下調泛素結合酶E2T(UBE2T)而觸發心肌細胞DNA的損傷，破壞心肌細胞基因組的穩定性，有效地促進了心肌細胞死亡和心力衰竭[14]。這標志著CaMKⅡδ9-UBE2T-DNA損傷途徑可能成為心肌病和心力衰竭的重要治療靶點。

4 CaMKⅡ的抑制

4.1 CaMKⅡ抑制劑 CaMKⅡ抑制有利于改善心肌功能，減輕心力衰竭的相關癥狀，如心腔擴張、肺水腫、心肌纖維化和細胞凋亡等[15]。鑒于CaMKⅡ具有廣泛的組織分布特性，在使用CaMKⅡ抑制劑時，很可能會對其他激酶產生潛在的靶外效應。要想更好地解決心血管疾病問題，不僅需要優化小分子CaMKⅡ抑制劑的藥代動力學特性，最大限度減少其通過血腦屏障對中樞神經系統的滲透，同時抑制劑還需要具備相對CaMKⅡδ異構體特異性。雖然近年來已經闡明了許多導致CaMKⅡ激活的途徑，但是幾乎沒有臨床上可行的影響CaMKⅡ活性的藥物。最常見的抑制劑KN-93通過競爭性阻斷CaM結合位點的方式來變構抑制CaMKⅡ，但是已有試驗證明了KN93同時抑制包括許多激酶和離子通道在內的其他靶點。具有口服生物利用度的CaMKⅡ抑制劑SMP-114，是一種最初用于治療類風濕性關節炎并在臨床試驗中進行測試的新型CaMKⅡ抑制化合物，能有效降低自發性舒張期肌漿網鈣離子漏出，并在一定程度上抑制晚期鈉電流，但遺憾的是SMP-114同樣缺乏激酶特異性[16]。GS-680是一種高度選擇性的CaMKⅡδ抑制劑，因顯著減少舒張期肌漿網鈣離子漏出，其在人心房小梁中具有很強的抗心律失常作用，能抑制心房期前收縮，這種抗心律失常作用是以收縮期心房收縮功能受損為代價的。然而，在終末期心力衰竭病人的心室肌中，GS-680能夠鈍化負性頻率關系，增加鈣瞬態振幅，改善人心室衰竭時的收縮能力[17]。雖然GS-680也可以抑制CaMKⅡα和β，但其效力遠低于CaMKⅡδ，這大大降低了神經元副作用的風險。AS105是一種高親和力的ATP競爭性CaMKⅡ抑制劑，與常用的KN93不同，AS105對磷酸化和未磷酸化的CaMKⅡ都能起到抑制作用。在心肌細胞實驗中發現，AS105能有效地減少肌漿網鈣離子漏出，增強肌漿網積累鈣離子的能力，在心律失常和心力衰竭方面都有治療潛力[18]。但是目前缺乏GS-680和AS105的口服生物利用度的相關報告。RA306是一種新型口服的ATP競爭性CaMKⅡ抑制劑，研究發現口服RA306能夠降低CaMKⅡ活性，顯著改善心力衰竭小鼠的心臟功能[19]。與KN-93相比，RA306具有更好的離子通道選擇性。實驗結果支持RA306這種新型口服CaMKⅡ抑制劑的臨床可行性。

4.2 中藥抑制CaMKⅡ治療心力衰竭 益氣藥黃芪、活血藥丹參是治療心力衰竭的常用藥，具有確切的臨床療效，在改善氣虛血瘀證的同時，可以改善心肌肥厚、延緩心力衰竭的進展。有研究發現，益氣藥可能通過抑制CaMKⅡ過表達，調控心力衰竭細胞L型鈣電流，縮短心力衰竭心肌細胞及心臟復極時間，改善心力衰竭電生理重構[20]。另有研究表明，中藥益氣活血方的抗心力衰竭機制可能與線粒體功能的改善有關，其通過調節ROS生成和CaMKⅡ信號通路改善心力衰竭小鼠線粒體功能障礙來達到抗心力衰竭的效果[21]。心力衰竭時由于CaMKⅡ等蛋白激酶激活使鈉離子通道磷酸化，引起晚期鈉電流增大是心力衰竭室性心律失常發生的病理機制之一，心電圖表現為QT間期延長。參連復脈顆粒具有益氣活血、清心化痰、寧心安神的功效，臨床治療心力衰竭室性心律失常安全有效。前期研究發現，參連復脈顆粒能夠縮短異丙腎上腺素引起的動作電位延長，并且君藥黨參能夠抑制心力衰竭心臟CaMKⅡ表達。參連復脈顆?？筛纳茐毫ω摵蓪е碌男牧λソ咝穆墒СＰ∈箅娚碇貥?，抑制心力衰竭心律失常。其作用機制可能與抑制CaMKⅡ表達、恢復鈉通道功能、抑制晚期鈉電流、調節細胞內離子濃度有關[22]。

4.3 其他途徑抑制CaMKⅡ 瞬時外向鉀電流(transient outward potassium current，Ito)的變化不僅是心力衰竭的繼發改變，也是其主要調控因素，可促進心力衰竭的發展進程。已經有研究證明Ito通道亞基Kv4.3與失活的CaMKⅡ蛋白之間存在物理偶聯。Kv4.3通道蛋白下調促使非活化的CaMKⅡ從Kv4.3-CaMKⅡ復合物中分離出來并被激活，加速心力衰竭過程[23]。其中Kv4.3作為內源性CaMKⅡ抑制劑，可以抑制CaMKⅡ活性，但不影響其表達。因此，通過上調Kv4.3通道蛋白來抑制CaMKⅡ過度活化，可能是治療心力衰竭的一大靶點。有研究發現，蛋白精氨酸甲基轉移酶1(PRMT1)通過甲基化CaMKⅡ的R9和275來抑制CaMKⅡ，心肌細胞中PRMT1缺乏會引起活性CaMKⅡ的水平顯著升高，從而導致擴張型心肌病，并伴有心肌細胞肥大和嚴重的纖維化，最終導致心力衰竭[24]。因此，CaMKⅡ的精氨酸甲基化可能為心力衰竭的治療提供一種新的策略。

除了使用CaMKⅡδ的藥理抑制劑外，運動也有可能成為一種治療方法。有益于心血管效應的運動似乎能夠對抗CaMKⅡδ在衰竭心臟中的負面影響。有研究發現游泳運動可以抑制1型糖尿病小鼠中O-GlcN酰化介導的CaMKⅡ激活，從而改善心臟狀況[25]。

5 前景與展望

目前，通常使用利尿劑、神經激素拮抗劑、β受體阻滯劑和血管緊張素轉換酶抑制劑治療心力衰竭。這些治療雖然能夠緩解癥狀，在一定程度上延緩疾病的發展，但往往不能從根本上解決心力衰竭問題。因此，具有高CaMKⅡδ選擇性和良好生物利用度的特異性藥物的開發可能是一個新的目標。局部遞送具有適當選擇性的ATP競爭性CaMKⅡ抑制劑在將來可能成為一種治療心力衰竭的新方法。