腦缺血再灌注痰瘀互結證動物模型的研究進展

白永軍，張令霖，連新福

缺血性腦卒中是一種具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率特點的常見腦血管疾病，而痰瘀互結證是缺血性腦卒中的常見中醫(yī)類型之一[1-2]。實驗動物模型是疾病生理病理研究的重要載體，是醫(yī)藥衛(wèi)生發(fā)展的不可或缺的支撐條件。早在1984年國際腦血管病委員會就曾提出，缺血性腦卒中的研究應以局部腦缺血動物模型為研究對象，并對該模型的制作方法提出了明確要求[3]。根據(jù)中醫(yī)學病證結合的診療理念，制作成功的腦缺血再灌注痰瘀互結證動物模型對缺血性腦卒中的研究具有重要意義。本研究從實驗動物的選擇、造模方法的選擇、線栓的選擇、進線深度、再灌注時間、中醫(yī)證型的建立等多個方面對腦缺血再灌注痰瘀互結證動物模型制作方法的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 實驗動物的選擇

目前，在人類疾病的基礎實驗研究中，大鼠、小鼠、犬、猴、家兔等為較常用的模型動物。但由于腦血管疾病研究的特殊性，實驗動物的選擇有所局限。猴雖具有和人類非常相近的高級神經中樞，但由于研究成本高昂，不利于開展大樣本的重復性研究；家兔的大腦皮層、神經血管發(fā)育不完善，無法達到理想的研究效果；而犬的頸部動脈分支豐富，不易通過阻斷單支血管形成穩(wěn)定病灶[4]。相比之下，大鼠由于具有與人類相近的腦血管解剖結構，能較好地模擬現(xiàn)代醫(yī)學上腦梗死的病理狀態(tài)；價格較為低廉，容易獲取，有利于大樣本重復性實驗的開展；大鼠的生理病理學研究較為成熟，可供參考的文獻資料豐富；頸部血管清晰，變異性小，手術操作容易；腦缺血面積容易掌控，梗死體積較大且恒定；性情溫順，種系純合型較好；繁殖、生長發(fā)育較快；血量較大，容易采集，可同時滿足一項研究中的多個指標的檢測需求等優(yōu)點，近年來十分受研究者青睞[5-7]。

國外研究發(fā)現(xiàn)，由于受雌性激素對腦神經保護作用的影響，雌性大鼠腦缺血后的梗死面積明顯小于雄性大鼠，因此，腦血管疾病的研究更多推薦選用雄性大鼠[8]。郭淑娟等[9]通過探究不同性別大鼠腦梗死體積及腦血流值的差異發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷后雌性大鼠的腦梗死體積明顯小于雄性大鼠，并推測這可能與雌性大鼠的低基礎腦血流值有關。閆峰等[10]亦研究發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠的腦血流基礎值明顯高于雌性大鼠，推測雌性大鼠腦梗死面積小、病死率低可能是由于其腦血流基礎值水平相對較低導致對腦缺血再灌注的耐受性提高引起的。黃會芝等[11]通過探討性別因素對新生大鼠的缺氧缺血性腦損傷腦發(fā)育的影響，結果發(fā)現(xiàn)新生雄性大鼠更容易受到缺氧缺血性腦損傷危害的影響，出現(xiàn)嚴重的腦損傷以及偏癱癥狀。

另外，動物的周齡大小和體重也會對實驗的成功率有一定的影響。當動物體重太小時，線栓不易插入，造模難度加大，甚至會損傷血管壁，導致出血意外；當體重太大時，可能會因為線栓無法很好栓塞血管，血流阻斷不完全，達不到理想的缺血效果。Tang等[12-14]研究發(fā)現(xiàn)，當造模大鼠約為8周齡大小，體質量控制在250～300 g時，既能達到理想的造模效果，又能將手術對大鼠造成的傷害降到最低。甄毅嵐等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，動物體質量是影響腦缺血再灌注造模穩(wěn)定性的重要因素，當雄性小鼠體重在25 g左右時，模型的死亡率相對較低，而成功率相對較高，是造模的理想選擇。

2 腦缺血再灌注動物模型的建立

2.1 造模方法的選擇 近年來創(chuàng)立發(fā)展的腦缺血再灌注動物模型的造模方法主要包括開顱電凝阻斷法、開顱結扎法、光化學誘導法、線栓法、氣囊栓塞法、顱外動脈注入微栓子等，其中線栓法最為常用[16-17]。采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注模型是由Koizumi等[18]在1986年首次提出的；1989年Longa等[19]對該造模方法進行了改良，為模擬人類疾病理想模型提供了一個全新的實驗方法。該方法具有不需要開顱、對動物損傷較小、操作簡單、缺血部位易于掌握且恒定、能有效控制再灌注時間、閉塞效果較為理想的特點，因此，被國內外研究者一直沿用至今。

為提高造模的成功率，解決插線困難、死亡率高等問題，近年來，有一些研究者對Longa的插線法又進行了一系列的改進。目前，線栓的進入方式主要有從頸外動脈殘端插入至頸內動脈顱內段和頸總或頸內動脈切口插入兩種。兩種進線方法各有優(yōu)劣，經頸外動脈插入魚線的方法通過游離頸總、頸外、頸內動脈，并從頸外動脈插入魚線直至顱內，該方法的優(yōu)點在于不需要結扎頸總動脈，能有效實現(xiàn)頸總動脈的再灌注，而缺點在于由于受頸內、頸外動脈之間形成的夾角的影響，導致造模手術的難度加大，甚至需要用顯微鏡輔助完成；相比之下，從頸總動脈進線操作難度低很多，但因該方法需要結扎頸總動脈，導致再灌注時主要借助對側循環(huán)來實現(xiàn)，這與臨床病人實際病理表現(xiàn)存在一定差異[20]。孫宇等[21]提出線栓從頸總近頸內外分叉處進入血管制備的大腦中動脈缺血再灌注模型梗死灶恒定、耗時少。徐秋英等[22]通過結扎右翼腭動脈、右頸外動脈后，在右頸外動脈距結扎處近心端處開一小口，將線栓經小口沿頸內動脈推進入顱以阻斷大腦中動脈血流復制腦缺血再灌注模型。

研究發(fā)現(xiàn)，造模過程中如果結扎或離斷翼腭動脈，在頸內動脈內的線栓周圍則更容易形成血栓，引起血管閉塞，影響再灌注時的血液供給。吳遠華等[23]主張在造模過程中不進行翼腭動脈的分離和結扎，這樣一方面可以縮短手術時間、降低組織損傷；一方面可以減少血栓形成、降低感染風險，從而最大限度地確保造模成功率。劉波等[24]發(fā)現(xiàn)以往方法制作的腦缺血動物模型在再灌注時容易出現(xiàn)栓線回縮，染色劑染色后顏色不明顯的現(xiàn)象，因此，其在線栓長度和染色操作上進行了改良，研究發(fā)現(xiàn)通過增加線栓長度可以明顯降低線栓回縮到切口的發(fā)生率，同時再灌注耗時也顯著縮短，另外采用棕色安瓿進行染色能提升染色的效果。

2.2 線栓選擇及進線深度 理想的大樣本腦缺血再灌注動物模型應該盡可能地具備梗死部位及面積一致、穩(wěn)定性高、可重復的特點，否則將可能嚴重影響研究結果的可信程度[25-26]。腦缺血再灌注動物模型的質量及成功率受多種因素影響，其中選擇合適的線栓至關重要。目前可供選擇的線栓種類繁多，其中包括尼龍線栓、魚線、聚乙烯醇線栓等。近年來許多學者研究發(fā)現(xiàn)，采用尼龍線制作的線栓造模對動物的影響最小，模型穩(wěn)定好，并且具有很好的可重復性。尼龍線栓使用較多的是3-0和4-0兩種規(guī)格的線，由于3-0尼龍線栓在操作時較4-0的線更容易導致蛛網膜下隙出血，因此4-0尼龍線更為常用。Koizumi等[18]曾提出通過在尼龍線前端包裹硅樹脂的方式制作標準的線栓；而Longa等[19]則主張通過燒灼的方法使尼龍線前端變成光滑圓頭，經加工后制作標準的栓塞線栓。

為進一步提升線栓的適用程度和造模成功率，有研究者對線栓的制備進行了改良。劉波等[24，27]在Longa EZ制作方法的基礎上進行了改良，即將尼龍線前端燒灼成圓形之后，放入多聚賴氨酸溶液中包裹后使用。李洪亮等[28]采用固體石蠟包裹的方式制備線栓，結果發(fā)現(xiàn)該方法制作的線栓前端光滑圓鈍、大小一致，在造模時不易損傷動脈血管，大大提高了造模的成功率和缺血再灌注效果。張文芳等[29]研究發(fā)現(xiàn)，對于體質量25～30 g的小鼠，采用頭部直徑為0.26 mm的線栓進行造模，成功率高，腦梗死面積大，且具有更好的可重復性。

另外，除了選擇合適的線栓之外，進線深度也是困擾研究者多年的疑難問題，進線深度太過容易刺破顱內Willis環(huán)血管，從而造成蛛網膜下隙出血，產生不可逆影響[30]。張亞敏等[27]研究發(fā)現(xiàn)，對于體質量為(238±6) g的大鼠，線栓進線深度為18 mm便能達到大腦中動脈入口處，此時指端會有明顯的阻力，不可強行用力，否則進線過深容易引起蛛網膜下隙出血，或者將大腦中動脈完全堵塞，出現(xiàn)大面積腦梗死。劉國軍等[31]通過對比研究發(fā)現(xiàn)，線栓進線深度越大大鼠腦梗死體積也越大，而大鼠成活的概率卻越小；當大鼠體質量在260～300 g時，進線深度控制在20 mm，能很好地保證造模成功率。在再灌注方面，Heydenreich等[32]建議在栓塞1.5 h后將線栓拔出，完成再灌注；劉婭迪等[33]則主張在2 h后拔出線栓，恢復腦血流24 h實現(xiàn)再灌注。

3 痰瘀互結證型的建立

成功的腦缺血再灌注痰瘀互結證動物模型對于研究腦梗死病人的生理病理特點以及臨床診治具有非常重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，脂質代謝紊亂和血液流變學的改變分別是“痰濁”“瘀血”的主要生物學機制之一[34]。腦動脈血管壁內皮損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動因素，而動脈粥樣硬化又是缺血性腦卒中發(fā)病的重要病理學基礎之一。動脈血管內脂質沉積、血小板聚集導致血管壁狹窄，血行遲緩，均屬于中醫(yī)學上“痰濁”“瘀血”的表現(xiàn)。凌爽等[35]研究痰瘀互結證型模型大鼠的血流動力學改變及紅細胞膜的生物學特征變化發(fā)現(xiàn)，通過喂養(yǎng)脂肪乳劑(由膽固醇、豬油、膽鹽等組成)可導致膽固醇升高，引起血漿黏度增大，紅細胞膜血清超氧化物歧化酶(SOD)酶活力降低。宋建民等[36]通過灌胃高脂食物(由豬油、膽固醇、甲基硫氧嘧啶組成)6個月后，插入微型雙極電凝鑷凝閉雙側椎動脈的方法復制痰瘀型腦缺血再灌注大鼠模型，并予以痰瘀同治的腦泰通顆粒治療驗證模型中醫(yī)證型成功。

潘永明等[37]通過高脂飼料喂養(yǎng)大耳白黑眼(WHBE)兔結合手術造模的方法建立痰瘀互結證心肌缺血模型，并通過檢測血脂代謝變化及血液流變學指標變化驗證模型中醫(yī)證型。李衛(wèi)民等[38]采用高脂飲食(由豬油、膽固醇、甲硫氧嘧啶、吐溫等組成)結合左側頸總動脈結扎的方法復制缺血性腦卒中痰瘀互結證大鼠模型，并通過檢測血脂、血栓素、纖溶酶原激活物抑制物(PAI)、血液流變學等指標的改變情況發(fā)現(xiàn)，該方法建立的模型符合腦卒中痰瘀互結證的臨床特點。劉抒雯等[39]采用脂肪乳(由羊油、膽固醇等組成)灌胃復合線栓法制作痰瘀互結證大腦中動脈阻塞大鼠模型，并利用具有痰瘀同治作用的扎里奴思方進行反證，結果發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，模型組血液流變學(全血黏度、血漿黏度)和血脂水平[總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)]均明顯升高，其癥狀符合痰瘀互結證的病理表現(xiàn)；而扎里奴思方干預組大鼠的全血黏度、血漿黏度以及脂質代謝紊亂狀態(tài)較模型組明顯改善，此研究證實通過高脂高膽固醇飲食結合大腦中動脈栓塞的方法可以成功復制腦缺血再灌注模型。

本課題組亦曾采用高脂喂養(yǎng)復合大腦中動脈阻塞的方法制作腦缺血再灌注痰瘀互結證大鼠模型，通過4周高脂飼料喂養(yǎng)后，大鼠血脂出現(xiàn)明顯紊亂，其癥狀表現(xiàn)符合動脈粥樣硬化和痰瘀互結證中“痰”的特點，再通過大腦中動脈栓塞的方法造成局部大腦缺血缺氧，其癥狀表現(xiàn)符合痰瘀互結證中“瘀”的特點[5]。

在構建腦缺血再灌注痰瘀互結證動物模型方面，普遍主張采用高脂喂養(yǎng)結合一側大腦中動脈栓塞的方式，該方法建立的模型會出現(xiàn)血脂代謝紊亂、血液流變學等生化指標的改變，符合缺血性腦卒中痰瘀互結證的特點。

4 小 結

經過30多年的發(fā)展，采用線栓法制作腦缺血再灌注動物模型的技術已趨于成熟，但關于病證結合動物模型的研究報道目前還很少。腦缺血再灌注痰瘀互結證動物模型同時具備了疾病西醫(yī)病理改變和中醫(yī)證候的特點，相比于單純的疾病模型，其更能全面、客觀、準確地反映中藥或者中成藥的作用機制。基于目前文獻研究結果了解到，大腦中動脈阻塞是公認的制作腦缺血再灌注動物模型的理想方法；而在復合高脂喂養(yǎng)之后，可以成功建立病證結合腦缺血再灌注痰瘀互結證動物模型。由于該模型的造模時間長、手術要求高、復合影響因素多，將來仍需要更多大樣本的實驗研究對造模細節(jié)進行改進優(yōu)化，以期為中醫(yī)藥治療腦血管疾病的研究提供更為優(yōu)質的動物模型。