干細胞與生物起搏的研究進展

陳雅婷，張建成，李 泱

目前，對于病態竇房結綜合征等嚴重緩慢性心律失常的治療策略主要是植入人工心臟起搏器，通過人工產生的電脈沖來控制心臟的跳動。雖然拯救了無數病人的生命并提高了其生命質量，但仍存在一些缺點和局限性，包括感染、金屬過敏、電極脫位、電子干擾和缺乏神經激素反應性。因此，“心臟生物起搏”已成為探究緩慢性心律失常治療的新方向。本研究結合近年來國內外最新文獻報道，對干細胞與生物起搏的研究進展進行綜述。

1 干細胞的研究現狀與進展

心臟生物起搏是指利用細胞分子生物學及其相關技術，對機體受損的自律性節律點或特殊傳導系統的細胞進行修復或替代，從而構建“生物起搏器”，得以恢復心臟的起搏和傳導功能，并從心臟生理功能和人體適應性的角度，避免了傳統電子起搏器的缺陷和嚴重并發癥，是邁向基于自體干細胞更理想的療法[1]。心臟生物起搏器的構建是今后的重要發展方向，其基礎和關鍵是找到理想的種子細胞。目前，用于構建心臟生物起搏的細胞主要為干細胞：包括胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)、間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。為了能夠從干細胞中分離獲得更多、更純的起搏樣細胞，大量研究聚焦于轉化因子促進干細胞向起搏樣細胞的誘導分化和階段性調控相關竇房結發育生物學信號級聯反應誘導干細胞分化為起搏樣細胞。

2 干細胞與生物起搏

2.1 ESCs與生物起搏 ESCs作為原始胚胎中的一類細胞，具有多向分化、無限增殖且自我更新的特性[2]。當ESCs誘導分化為具有起搏功能的心肌細胞時，有效地提高ESCs衍生心肌細胞的總產量和富集純的心肌細胞變得尤為重要。ESCs來源的心肌樣細胞一般是從胚狀體中跳動區域分離得到的，這些早期的心肌細胞具有起搏細胞的特性，可作為構建生物起搏器的種子細胞，但這些細胞的數量少、純度不理想。為了能夠從ESCs中分離獲得更多、更純的起搏樣細胞，ESCs誘導分化的研究陸續展開。

2.1.1 ESCs分化與轉化因子 為了能夠從ESCs中分離獲得更多、更純的起搏細胞，大量研究聚焦于操縱Shox2、Tbx、HCN等轉錄因子及起搏基因的表達來促進ESCs向起搏樣細胞的誘導分化。Ionta等[3]直接將Shox2基因轉染至小鼠ESCs(mESCs)，誘導分化獲得起搏樣細胞并成功構建了生物起搏器。Scavone等[4]研究發現，ESCs中CD166+的細胞可發育為竇房結樣細胞，這些細胞可高表達參與竇房結細胞發育的相關基因Tbx18、Tbx3、Isl-1和Shox2等，以及相關功能基因Cx30.2、HCN4、HCN1、CaV1.3等，并低表達心室肌基因Cx43、Kv4.2、HCN2、Nkx2.5，且與小鼠的竇房結細胞形態相似并具有起搏特性，與新生大鼠心室肌細胞共培養表現出更快的跳動頻率，這揭示了CD166+可作為篩選竇房結樣細胞的重要細胞外標志蛋白。Hoffmann等[5]在此研究基礎上，為了驗證竇房結細胞中Shox2依賴性的發育機制，通過5種不同的竇房結樣細胞誘導方案，從分離出Shox2+CD166+和Shox2-CD166+竇房結樣細胞中發現，Shox2+CD166+竇房結樣細胞表達有更多的竇房結標志基因，表明僅以CD166+作為有效富集純化竇房結樣細胞的標記仍有不足，且目前尚未有CD166+ESCs的在體動物研究結果，值得進一步的探究。Jung等[6]將人Tbx3和Myh6啟動子相結合構建穩定的組成型Tbx3過表達mESCs，其衍生的心肌細胞聚集體中>80%在蛋白質表達和電生理參數上具有起搏器表型所需的功能特征，且每分鐘的搏動頻率達300～400次。Saito等[7]將兔HCN4基因轉染至小鼠ESCs，誘導分化為mESC-CMs，產生快速的自發搏動和起搏電流，且對起搏電流抑制劑伊伐布雷定和激動劑異丙腎上腺素有生物反應性，在體外與其他可興奮細胞共培養具有同步收縮起搏能力，可用于生物起搏器的構建。

2.1.2 ESCs分化與發育生物學信號通路的調控 研究表明，通過調控竇房結發育生物學的相關信號通路來誘導ESCs分化為竇房結樣細胞。Zhu等[8]通過調控NRG-1β/ErbB信號傳導來調節hESC-CMs分化培養物中的竇房結樣細胞與工作型心肌細胞的比例，發現NRG-1β/ErbB信號的抑制可增加具有竇房結樣細胞的比例，同時降低工作型心肌細胞。Birket等[9]發現在誘導ESCs分化為心肌細胞過程中，可分為Nkx2.5陽性表達(Nkx2.5+)的工作心肌細胞和Nkx2.5陰性表達(Nkx2.5-)的竇房結樣起搏細胞，后者表達高水平竇房結發育相關基因及起搏離子通道基因，電生理檢測記錄到竇房結細胞樣的動作電位及起搏電流，當培養到30 d，Nkx2.5-細胞群依然保持著起搏細胞的特征和搏動頻率。Protze等[10]通過骨形成蛋白-4(BMP4)、視黃酸(RA)和成纖維細胞生長因子抑制劑(FGFi)的序貫誘導提高Nkx2.5-hESCs的比例，且在Nkx2.5-hESCs中記錄到舒張期去極化的動作電位，起搏電流If、ICa，T、Ik，ATP，其對β受體激動劑和抑制劑具有良好的生物反應性，將富集到的Nkx2.5-hESCs移植到大鼠的左室心尖部，能夠成功起搏用藥物誘導出房室傳導阻滯的心臟，并用Optical mapping技術記錄到起搏點源于移植部。Liang等[11]通過添加激活經典Wnt/β-catenin信號傳導的外源性Wnt3a配體，可增加起搏器樣心肌細胞的產量，起搏器表型伴隨著竇房結樣細胞的特異性基因和基因產物的表達而增強，同時減少肌鈣蛋白T(cTnT)陽性心肌分化，此結果表明Wnt/β-catenin途徑是ESCs分化過程中心肌亞型發生的關鍵決定因素：內源性Wnt信號傳導的激活有利于起搏器譜系的表達，而其抑制則促進了室性心肌細胞譜系。此外，研究表明，蘇拉明、內皮素-1和鈣激活的鉀通道可促進胚胎干細胞誘導分化為竇房結樣細胞，竇房結特異性標志物表達水平顯著上調[12-15]。

關于ESCs的研究證實了ESCs可以誘導分化為起搏樣心肌細胞，并用于心臟生物起搏器的構建，但這些細胞始終存在倫理學的問題，且免疫原性、成瘤性問題也一直受到關注。此外，精確調控ESCs定向誘導分化、純化等問題尚需解決。

2.2 MSCs MSCs是一種非造血的基質細胞，根據來源主要分為骨髓間充質干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和脂肪干細胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，具有自我更新和多向分化潛能，且獲取相對容易，可取自病人自身，不存在組織相容性問題，適宜自體移植等優點，成為生物起搏的種子細胞。然而，MSCs不具有電生理活性但表達縫隙連接蛋白，向起搏細胞的分化相對困難，更多的研究將MSCs作為一種目的基因的載體，通過轉染起搏基因或調控竇房結分化的轉錄因子可獲得起搏樣細胞，與周圍心肌形成電偶聯發揮生物起搏功能[16]。

2.2.1 MSCs分化與起搏基因 早期研究多轉染單個起搏基因構建生物起搏器，Cheng等[17]將小鼠的HCN4轉染至犬間充質干細胞(cMSCs)，從而產生Cs+敏感的起搏電流，將所轉染的3×106cMSCs注射至右心室心外膜下，發現注射部位自發產生心室節律，搏動頻率為(45±9)次/min，表明基因修飾的cMSCs可以在體外和體內表達功能性HCN4離子通道，作為心臟傳導系統重要的起搏基因。Darche等[18]將起搏HCN4轉導入人類BMSCs和ADSCs并與新生大鼠心室肌細胞共培養以促進起搏樣細胞的誘導分化，2周后，轉染的人類ADSCs表現出更早的自發性收縮和更快的搏動速率且具有規律性和同步性，同時產生具有心臟起搏器組織特征的離子通道(CaV1.2，NCX1)、轉錄因子(Tbx3，Tbx18，Shox2)和縫隙連接蛋白(Cx31.9，Cx45)。Wei等[19]用同樣的方法獲得竇房結樣細胞，在Ⅲ度房室傳導阻滯模型犬左室前壁進行注射，連續6周觀察后發現，起源于移植部位的平均自主節律[(59±5)次/min]較未移植對照組[(38±2)次/min]明顯上升，且具有心律變異性。但是，隨著時間的推移，源自移植部位的自主節律開始逐漸下降。究其原因，可能與移植細胞的凋亡、流失或未能與周圍心肌細胞形成良好的電機械偶聯有關。Yang等[20]用攜帶小鼠鈣激活鉀通道的SK4基因的重組腺病毒載體轉導ADSCs，體外培養5～7 d后將轉導的ADSCs植入大鼠左心室游離壁，2周后，在離體的灌流大鼠心臟中建立完全性房室傳導阻滯，移植部位產生了異位節律并承擔了生物起搏器的

功能；同時，SK4在ADSCs中的穩定地表達促進ADSCs的分化，Shox2和HCN4的表達上調，產生起搏電流且可被CsCl所抑制，以及誘導了p-ERK1/2和p-p38 MAPK的表達。這揭示了p38-MAPK和ERK1/2信號通路的激活可促進起搏樣細胞的誘導分化，為心臟生物起搏器的構建提供了新思路。

2.2.2 MSCs分化與轉錄因子 近年來的研究聚焦于轉染竇房結發育相關的轉錄因子，可促進BMSCs或ADSCs向竇房結樣細胞誘導分化，竇房結特異性標志物表達增加并產生起搏電流。張健等[21]將過表達胰島素基因增強子結合蛋白1(insulin gene enhancer binding protein-1，ISL-1)的ADSCs與乳鼠心室肌細胞共培養7 d促進起搏樣細胞的誘導分化，發現竇房結特異性基因表達上調，同時工作心肌特異性基因表達下調，且大多數細胞可記錄到起搏電流，表明ADSCs經單一轉錄因子ISL-1的基因修飾可在體外心肌微環境中，誘導產生竇房結樣細胞。Feng等[22]將Shox2轉染至犬BMSCs并與乳鼠心肌細胞共培養7 d以上，誘導分化為起搏樣細胞，高表達起搏基因Tbx3、HCN4、Cx45，而低表達心室基因Nkx2.5和Cx43，且可在體外快速起搏乳鼠心室肌細胞。Hu等[23]將Tbx18轉染至豬BMSCs促進起搏樣細胞的誘導分化，細胞形態由紡錘形變化為條帶狀，在第10天，約7%的BMSCs-Tbx18中觀察到了搏動，搏動頻率約為90次/min，并且該搏動可以在體外持續約3周，同時Tbx18、肌鈣蛋白I(cTnI)、HCN4、α-SA的表達增加，將轉導的BMSCs植入豬右心室并成功起搏竇房結功能障礙的心臟，且對β-腎上腺素能激動劑有反應性。Zhang等[24]通過將轉錄因子的組合(ISL-1和 Tbx18)共同轉染脂肪干細胞，再與新生大鼠心室肌細胞體外共培養7 d后，誘導ADSC成功分化為起搏樣細胞。更多的研究在體外證實，通過多種方法將Tbx18轉染至BMSCs或ADSCs可促進其向竇房結樣細胞誘導分化，竇房結特異性標志物表達增加并產生起搏電流。由于BMSCs和ADSCs不具有電生理活性，本身并不具備起搏細胞的結構基礎，鑒于竇房結電生理特征的復雜性，單一的導入起搏基因所構建的起搏樣細胞特性與竇房結細胞仍有明顯的差異，但要更加接近生理性的竇房結細胞功能，需要轉導大量的離子通道基因和相關轉錄因子，這是很大的工程，難以付諸實踐。

2.3 iPSCs iPSCs是通過導入特定的轉錄因子將終末分化的體細胞重編程為多能性干細胞。2007年Takahashi等[25]通過4種特定轉錄因子Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc的轉染將人皮膚成纖維細胞重編程為iPSCs，自此揭開了人體細胞重編程的帷幕，也迅速成為干細胞領域的研究熱點。iPSCs獲得方法相對簡單并且穩定，可取自自體細胞，不需要使用卵細胞或者胚胎，跨越了細胞移植所帶來的免疫排斥、倫理爭議等問題。此外，iPSCs在形態學、表面標志物及端粒酶活性等方面與ESCs具有相似性，且在多種轉化方法的應用下，可大大降低非定向分化導致的致瘤性。這些特性使iPSCs相較于成體干細胞移植，能夠更好地整合到宿主心臟組織中。

Mandel等[26]對誘導iPSCs來源的心肌細胞(iPSC-CMs)進行連續15 d的觀察記錄，發現其搏動頻率非常穩定，具有一定的節律變異性，對乙酰膽堿和β-腎上腺素刺激存在生物反應性，但起搏頻率僅為30～50次/min，表明iPSC-CMs具有一定的起搏功能。Chauveau等[27]首次使用源自人的iPSC-CMs創造了一種生物起搏器，將40～75個由自發搏動的iPSC-CMs組成的節律收縮的胚狀體注射到左心室，在完全性心臟傳導阻滯犬模型中可以在體內與心室肌整合，從而構建心臟生物起搏器，但iPSC-CMs心臟起搏器的速度和節奏仍有待優化。

研究表明，不同的誘導方法獲得的iPSC-CMs的搏動頻率也不盡相同；同時也有研究表明，在干細胞衍生的心肌中，存在著一些細胞具有竇房結細胞的特征，但這種細胞的比例較少，甚至是一過性的[28]。因此，尋找新的誘導方法促進iPSCs分化為高表達竇房結特異性基因、高純度且具有起搏功能的竇房結樣細胞，已成為構建生物起搏器亟須解決的問題。

2.3.1 iPSCs分化與轉錄因子 胚胎期的轉錄因子能夠從竇房結發育的上游信號通路調控細胞的發育，導入竇房結細胞轉錄因子可調控iPSCs更多地向竇房結樣細胞分化。王蕓等[29-30]分別將Tbx18用不同的方式轉染至hiPSC-CMs促使其向起搏樣細胞誘導分化，發現起搏特異性基因HCN4表達上調，心室肌特異性基因如鈉電流(SCN5A，INa)、內向整流鉀電流(Kir2.1，IK1)、CX43表達下調，從而表明Tbx18基因的傳遞具有開發生物起搏的潛力，能夠促進hiPSC-CMs分化為起搏樣細胞。Zhao等[31]將Tbx3和HCN2共同轉染hiPSC-CMs以重編程為起搏樣心肌細胞，工作型心肌細胞特異性標志CX40、CX43、SCN5A、Kir2.1的表達下調，而竇房結細胞特異性標志CX30.2和CX45的表達增加，并產生竇房結細胞樣的動作電位和起搏電流。Tbx3和HCN2的共表達促使舒張期最大

去極化電位以及起搏電流的產生，其協同作用產生起搏細胞的最典型特征——自發性舒張期去極化，為構建生物起搏器提供新策略。Gorabi等[32]將Tbx18轉染的hiPSC-CM產生的起搏樣細胞注射到大鼠的左心室前外側壁，進行心臟離體實驗構建完全性心臟傳導阻滯后，心率顯著增加、心室纖顫持續時間較少，且上調HCN4表達及下調Cx43表達，故通過細胞和基因治療策略導入Tbx18基因后，可證明功能性起搏器的形成。

2.3.2 iPSCs分化與發育生物學信號通路的調控 Protze等[10]通過對發育信號通路的階段性調控，誘導人多能干細胞分化為竇房結樣起搏細胞，該研究基于Nkx2.5表達與否將心肌細胞進行分類，結果顯示Nkx2.5-的細胞可高表達竇房結細胞特異性標志物，并可記錄到起搏電流，將其移植至房室傳導阻滯模型大鼠的心尖部位，可有效起搏心臟周圍的組織，進而證明其具有生物起搏功能。通過該方法誘導的起搏樣細胞數量多、純度高，為iPSCs成功構建生物起搏提供了新的借鑒，但生物起搏的效果需要進行大型動物的相關研究。Ren等[33]揭示經典的Wnt信號傳導在指導中胚層細胞命運決定的基因調控上發揮作用，促使起搏細胞的分化。在斑馬魚中，起搏器心肌細胞衍生自Nkx2.5+中胚層的一個子集，該子集對典型Wnt5b信號做出響應以啟動心臟起搏器程序，包括心臟起搏器細胞分化轉錄因子Isl-1和Tbx18的激活以及Nkx2.5的沉默。通過發現起搏器心肌細胞的起源，揭示了進化上保守的Wnt信號傳導機制，該機制協調了指導中胚層細胞命運決定的基因調控變化，從而導致起搏器心肌細胞的分化。研究發現通過小分子抑制劑CHIR99021處理，在分化的第5天能重新激活心臟祖細胞經典Wnt信號傳導，可促進TNT2起搏樣心肌細胞的分化且起搏特異性基因表達增加，表明Wnt5b信號在體外可促進hiPSC起搏樣心肌細胞的誘導分化，為心臟生物起搏治療提供了潛在的策略。與此同時，雖然此研究與協同操縱的多個信號通路誘導起搏樣細胞的研究不同，但在心臟發育過程中重新激活經典的Wnt信號傳導，可能通過協調階段性的信號傳導級聯反應來介導心臟起搏器細胞的發育，該信號傳導級聯反應可能包括BMP信號傳導和其他信號傳導途徑(FGF和RA)指導心臟祖細胞趨向于心臟起搏器的命運，且抑制了它們分化為其他心肌細胞類型[10]。

3 小 結

心臟生物起搏器的構建可通過轉化因子和竇房結發育生物學信號級聯的調控等方式促進干細胞向竇房結樣細胞誘導分化，作為病態竇房結綜合征及Ⅲ度房室傳導阻滯等嚴重緩慢性心律失常一種新型的細胞治療手段，具有獨特的優勢。如今，起搏樣細胞的誘導分化仍困難重重，探索路程漫長而任重道遠。但是，生物起搏器替代電子起搏器仍是未來的發展方向，相信在不遠的將來，通過不斷的實驗研究，心臟生物起搏器可以安全有效地應用于緩慢型心律失常病人的臨床治療當中，為人類帶來福音。