免疫檢查點在皮膚腫瘤中的研究進展

劉亭亭 劉 紅 張福仁

山東第一醫科大學附屬皮膚病醫院(山東省皮膚病醫院)，山東省皮膚病性病防治研究所，濟南，250022

皮膚腫瘤是原發于皮膚或其附屬器的腫瘤或由其他內臟器官、組織的惡性腫瘤轉移到皮膚的轉移瘤。皮膚腫瘤是現在比較難以治療的皮膚科疾病，主要包括黑素瘤(melanoma)、默克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma, MCC)、皮膚T細胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma, CTCL)、基底細胞癌(basal cell carcinoma, BCC)和皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, cSCC)等。皮膚腫瘤的發病率與T細胞的免疫抑制呈正相關性，CD4+T或CD8+T細胞的免疫抑制會增加個體罹患cSCC[1]、BCC[2]、MCC[3，4]、Kaposi肉瘤[5]和惡性黑素瘤[5]的風險。這既反映了腫瘤的免疫原性，也揭示了T細胞對監測和控制腫瘤發生的重要性[6]。

鑒于T細胞功能缺陷與皮膚腫瘤發生的相關性，多種調節T細胞的免疫療法已被應用于皮膚腫瘤的治療，如Ⅰ型干擾素療法和白介素2(IL-2)療法。I型干擾素具有多種功能，不僅能激活T細胞，還能增強腫瘤固有抗原的提呈，目前已被應用于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、肝癌等疾病的治療[7]。然而Ⅰ型IFN特別是IFN-α2b，特異性較弱，單獨使用時效果不顯著且不良反應明顯，短期不良反應導致疲勞、發熱、寒顫、頭痛和惡心等癥狀，長期不良反應導致較為嚴重的腎毒性、肝毒性、內分泌紊亂等[7]。IL-2是一種細胞因子，可以促進T細胞和自然殺傷(natural killer，NK)細胞的擴增。盡管IL-2能夠通過擴增CD8+T效應細胞來提高免疫反應，它也會促進調節性T細胞(regulatory T cells, Treg)擴增來抑制效應T細胞對腫瘤的殺傷效應[8]。因此，傳統的免疫療法如Ⅰ型干擾素和IL-2對于皮膚腫瘤的治療并未獲得顯著療效。

近年來多項研究發現，黑素瘤、CTCL、cSCC、BCC和MCC等皮膚腫瘤患者T細胞高表達多種免疫抑制受體，新興免疫療法通過阻斷免疫抑制受體可以顯著提高患者的中位生存期和客觀緩解率[9，10]。免疫抑制性受體也被稱為免疫檢查點，是一類免疫抑制性分子，其高表達可使T細胞發生耗竭，效應功能喪失，從而減少對腫瘤細胞的免疫監視及殺傷作用，導致腫瘤細胞發生免疫逃逸[11，12]。目前，研究最為廣泛的免疫檢查點為細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen, CTLA-4)、程序性死亡受體1(programmed death 1, PD-1)、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3, TIM-3)、T細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制性基序結構域(T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain, TIGIT)、淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)[11，13]。2018年James P Allison和Tasuku Honjo因分別發現CTLA-4和PD-1及PD-L1而被授予諾貝爾生理學或醫學獎，這也使得近年來免疫檢查點相關的研究備受關注。

CTLA-4是第一個臨床靶向的免疫檢查點[14]，它在T細胞上表達，與CD28共享相同的配體(CD80和CD86)，主要調節T細胞激活的早期階段。PD-1在T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞及NK細胞表面表達，其配體是PD-L1和PD-L2[15]。TIM-3在CD4+Th1、CD8+Tc1、Th17、Treg、NK細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(Dendrtic cell, DC)表達[13，16]，其配體是Galectin-9(Gal-9)、CEACAM1、PtdSer和HMGB1[17]。TIGIT在T細胞、NK細胞和Treg細胞中特異性表達[18，19]，TIGIT和CD226共享同一組配體，CD155和CD112。LAG-3主要在T細胞、B細胞、DC細胞和NK細胞中表達[20]，其配體是MHC-Ⅱ類分子、galectin-3、LSECtin和α-synuclein等。

免疫檢查點與其相應受體的相互作用的機制為：T細胞表面表達CTLA-4、PD-1、TIM-3、TIGIT和LAG-3等免疫檢查點，抗原遞呈細胞(antigen presentation cells, APC)表面表達各種免疫檢查點的受體如CD80/CD86、PD-L1/PD-L2、galectin9、CD155/CD112和MHCII，免疫檢查點與其相應受體結合會直接抑制效應T細胞的活性；另一方面，高表達免疫檢查點的Treg細胞會通過分泌IL-10間接抑制效應T細胞的活性。

1 免疫檢查點在皮膚腫瘤中的研究進展

免疫檢查點是免疫系統的抑制性調節分子，參與維持機體自身抗原的免疫耐受，通過與相應配體的相互作用，調節靶細胞的功能狀態，在腫瘤中發揮重要的免疫調控功能。

1.1 黑素瘤 在黑素瘤患者中，T細胞CTLA-4的表達水平升高，并伴隨著MIP-1β、TNF-α和IFN-γ分泌的減少[21]；Treg細胞CTLA-4表達上調并分泌更多的IL-10[22]。Chapon等[23]的研究發現，在原發性黑素瘤腫瘤浸潤的CD4+T和CD8+T細胞高表達PD-1；并且在已轉移的晚期皮膚癌組織中，PD-1的表達水平進一步升高；分離腫瘤浸潤T細胞，體外刺激后產生的IFN-γ減少。在晚期黑素瘤患者中，約有30%的CD8+T細胞共表達PD-1和TIM-3；且與TIM-3-PD-1+細胞相比，TIM-3+PD-1+亞群表現出更加失能的表型，產生的TNF-α、IFN-γ和IL-2進一步減少[24]。Chauvin等[25]發現，黑素瘤患者腫瘤抗原特異性CD8+T細胞和腫瘤浸潤的CD8+T中，TIGIT表達均上調，并且TIGIT的高表達往往伴隨著PD-1水平的升高；同時阻斷TIGIT和PD-1可增加CD8+T細胞的增殖、細胞因子的產生和顆粒酶的分泌。在B16F10細胞誘導小鼠黑素瘤模型中，Tregs細胞高表達TIGIT且分泌的IL-10顯著升高，其中約有60%的TIGIT+Tregs細胞共表達TIM-3并呈現更強的抑制功能[26]。Xu等[27]報道，在表達LSECtin(LAG-3配體)的黑素瘤細胞存在的情況下，LAG-3會抑制T細胞IFN-γ的產生；在黑素瘤患者的外周血和腫瘤組織中，LAG-3在Treg細胞上高表達，并通過產生高水平的IL-10和TGF-β，抑制腫瘤特異性T細胞的效應[28]。

1.2 皮膚T細胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma, CTCL) 蕈樣肉芽腫(Mycosis fungoides, MF)和Sézary綜合征(Sézary syndrome, SS)是兩種最常見的CTCLs。免疫組化分析15例限制性斑塊期MF、15例泛發性腫瘤期MF和11例SS患者皮損，發現PD-1的陽性率分別為40%(6/15)、60%(9/15)和73%(8/11)，41例CTCL總陽性率為56%；同時，在5例SS患者外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中也檢測到PD-1在CD4+T細胞中的高表達[29]。Cetinozman等[30]比較了皮損T細胞表達PD-1的比例超過50%的樣本，SS患者為89%(24/27)，而MF患者為13%(8/60)，結果顯示PD-1在SS和MF之間的表達存在差異。與紅皮病型炎癥性皮膚病(12例自發性、10例特異性、6例銀屑病和2例副腫瘤)相比，25例SS患者中有23例(92%)超過50%的浸潤T細胞表達PD-1，而紅皮病型炎癥性皮膚病只有4例(13%)；SS中PD-1主要是在腫瘤CD4+T細胞表達，而紅皮病型炎癥性皮膚病PD-1主要在真皮和表皮CD8+T細胞表達[31]。除了PD-1外，CTCL患者也高表達其它免疫抑制性受體如CTLA-4和LAG-3：與健康皮膚相比，CTCL患者皮損中CD4+T細胞高表達PD-1、CTLA-4和LAG-3，CD8+T細胞高表達CTLA-4和LAG-3；同樣地，通過對CTCL患者皮損樣本進行mRNA表達譜分析發現，與T1/T2期患者相比，T3/T4晚期患者樣本免疫檢查點相關的mRNA表達上調[32]。

1.3 基底細胞癌(basal cell carcinoma, BCC)和皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, cSCC) 在40例BCC患者腫瘤微環境中，9例(22%)腫瘤細胞表達PD-L1，33例(82%)腫瘤浸潤淋巴細胞和巨噬細胞表達PD-L1；40例(100%)腫瘤浸潤淋巴細胞表達PD-1；且腫瘤或巨噬細胞上PD-L1的表達與淋巴細胞上PD-1的表達呈現正相關性[33]。來源于62例BCC患者的138個腫瘤組織樣本中，124例(89.9%)腫瘤細胞中PD-L1表達呈陽性，131例(94.9%)腫瘤浸潤淋巴細胞PD-L1表達呈陽性[34]。在61例cSCC患者腫瘤微環境中，25例(41%)PD-L1呈陽性，37例(61%)PD-L2呈陽性，利用CD1a和CD83分別標記未成熟和成熟的DC，發現cSCC患者腫瘤組織CD1a+未成熟DC 中PD-L1和PD-L2的表達明顯高于CD83+成熟DC；PD-L1的表達率與腫瘤等級相關，而PD-L2的表達率與cSCC分化和腫瘤大小相關[35]。比較40例原發性和5例轉移性cSCC患者發現，20例低轉移風險的患者中有4例(20%)表達PD-L1，20例高轉移風險的患者中有14例(70%)表達PD-L1，而轉移性患者5例(100%)均表達PD-L1，表明PD-L1的表達水平與腫瘤轉移風險呈正相關性[36]。

1.4 默克爾細胞癌(Merkel cell carcinoma, MCC) MCC患者外周血CD8+T細胞和腫瘤浸潤的淋巴細胞中高表達PD-1和TIM-3,其中90%TIM-3+T細胞共表達PD-1；在整個疾病過程中，CD8+T細胞一直表達高水平的PD-1；腫瘤組織中PD-L1的表達與腫瘤浸潤的CD8+T細胞呈正相關性[37]。MCC患者腫瘤浸潤T細胞低表達活化標記物CD69和CD25，卻高表達耗竭標記物PD-1；同時DC和巨噬細胞的PD-L1和PD-L2表達也上調[38]。總之，大約42%～49%的癌細胞、55%腫瘤浸潤細胞和39%的瘤周巨噬細胞高表達PD-L1；腫瘤細胞表達PD-L1的患者均存在中等或高度淋巴細胞浸潤；而PD-L1和PD-1表達水平與年齡、性別和初始診斷均不相關[39,40]。這些結果表明，PD-1/PD-L1信號是MCC治療的潛在靶標。

綜上，在各種皮膚腫瘤微環境中，CTLA-4、PD-1、TIM-3、TIGIT和LAG-3等免疫檢查點高表達：一方面，在T細胞中高表達，可以競爭性的抑制共刺激因子對T細胞的活化，直接誘導效應T細胞的耗竭；另一方面在Treg中高表達，增強Treg細胞的免疫抑制功能，間接性的誘導效應T細胞的失能。

2 免疫檢查點抑制劑在皮膚腫瘤的臨床應用

基于免疫檢查點在腫瘤中的作用機制，近年來，免疫檢查點抑制劑已成為治療腫瘤的熱點，通過阻斷免疫檢查點，激發自身免疫反應，在實體腫瘤中成效顯著，能夠明顯改善患者的預后。因此，詳細探討不同腫瘤微環境條件下免疫檢查點的生物學效應將為腫瘤免疫干預提供新的思路。靶向CTLA-4、PD-1和PD-L1的抗體已經廣泛應用于黑素瘤、CTCL、MCC和BCC的治療。

2.1 CTLA-4 CTLA-4單抗與CTLA-4結合后可阻斷CTLA-4與CD80/CD86的相互作用，進而阻斷抑制性信號向T細胞的傳遞，從而刺激T細胞的免疫應答[12]。經過長達10年的臨床試驗后，2011年3月，第一個T細胞靶向抗體CTLA-4單抗ipilimumab，被批準用于治療不可切除或轉移性黑素瘤患者。比較ipilimumab和糖蛋白治療晚期黑素瘤患者的臨床數據，中位生存期分別為10.1個月和6.4個月，治療12個月的總生存率分別為45.6%和25.3%，18個月為33.2%和16.3%，24個月為23.5%和13.7%[9]。MF患者經過三次ipilimumab治療后，所有皮膚MF病變消失[41]；SS患者接受ipilimumab治療后，也表現出顯著的臨床反應，包括紅斑減少50%，皮膚和皮下腫瘤大小減少75%，小腿潰瘍減少50%，瘙癢程度減弱，正常生活活動得以恢復[42]。鑒于作為可切除MCC輔助治療方案的效果不佳，ipilimumab用來治療MCC的案例比較少見[43]。

盡管與化療和傳統免疫療法相比，ipilimumab可以提高患者的中位生存期和客觀緩解率，與PD-1/PD-L1靶向治療相比，CTLA-4單抗面臨兩個挑戰：療效不佳和毒性較強[44]。Weber等[45]比較nivolumab(PD-1單抗)和ipilimumab在906例晚期黑素瘤的療效：nivolumab治療患者一年無復發生存概率為70.5%，而ipilimumab為60.5%；nivolumab治療患者中有14.4%報道了嚴重免疫治療相關不良事件，而ipilimumab則為46.2%；由于嚴重的毒性，9.7%的nivolumab治療患者和42.6%的ipilimumab治療患者會停止治療。Larkin等[46]的臨床試驗發現，對于晚期黑素瘤患者，nivolumab治療平均生存36.9個月，而ipilimumab只有19.9個月。此外，盡管抗PD-1治療已被批準用于黑素瘤、肺癌、肝癌、腎癌和淋巴瘤等，抗CTLA-4治療在很大程度上依然只局限于黑素瘤[47]。

盡管ipilimumab單藥治療存在這些問題，Tawbi等發現ipilimumab與nivolumab聯合治療可以進一步改善抗PD-1抗體的治療反應，如提高總生存期、客觀緩解率和無進展生存期時間等，因此臨床上推薦聯合使用ipilimumab和nivolumab進行黑素瘤等的治療[46,48]。

2.2 PD-1 PD-1和PD-L1抑制劑可阻斷PD-1/PD-L1的相互作用，激活T細胞，減少腫瘤微環境中免疫抑制成分，從而達到抗腫瘤的目的[49]。2014年，美國食品藥品監督管理局批準了首個抗PD-1單克隆抗體nivolumab，用于不可切除或轉移性黑素瘤的二線治療[50]。此后，多種抗PD-1抗體(pembrolizumab, cemiplimab)和抗PD-L1抗體(atezolizumab, avelumab, durvalumab)也陸續用于癌癥治療[51]。自PD-1/PDL-1阻斷藥物上市以來，臨床獲益最大的是黑素瘤患者。例如，在晚期轉移性黑素瘤的治療中，pembrolizumab單抗能在誘發最小毒性的條件下提高患者的總體生存期，與ipilimumab治療組相比，pembrolizumab單抗將12個月總生存率從58.2%提升至74.1%，而不良反應率則從19.9%降至10.1%[10]。目前，這些PD-1/PDL-1靶向藥物已被用于黑素瘤的一線治療[50,52]。在晚期BCC病人中，9例患者接受pembrolizumab單藥治療，9例患者使用pembrolizumab和維莫德吉聯合治療，18周時客觀緩解率分別為44%和29%，一年內無進展生存率為 62%和83%[53]。對于晚期cSCC，抗PD-1藥物cemiplimab的客觀緩解率為47%[54]；對于MCC，pembrolizumab[55]和avelumab[56]的客觀緩解率分別為56%和62%，這些藥物也可以顯著提高患者的總生存率。

與其它免疫療法相比，在CTLA-4單抗ipilimumab難以治愈的黑素瘤中，PD-1阻斷劑pembrolizumab可以發揮很好的療效[57,58]；PD-1阻斷劑誘發的毒性顯著小于IL-2治療和CTLA-4單抗治療[52]。與其他癌癥療法(包括輻射、化療和手術)相比，盡管PD-1/PD-L1阻斷藥物也會出現不良事件和復發等，其治療機制在于靶向目標細胞，所以更為安全[15,59]。

2.3 TIM-3 盡管在臨床前小鼠模型中，單獨抑制TIM-3往往對腫瘤生長影響甚微，而2010年Sakuishi等[60]在結腸癌小鼠模型中發現，腫瘤浸潤CD8+T細胞高表達TIM-3，且幾乎所有TIM-3+浸潤淋巴細胞均共表達PD-1，TIM-3+PD-1+細胞表現出最嚴重的耗竭表型，無法產生IL-2、TNF和IFN-γ，PD-1和TIM-3聯合靶向治療可顯著降低腫瘤生長，效果優于任一單藥靶向治療。

大量臨床前數據表明聯合阻斷PD-1/TIM-3會增強腫瘤抗原特異性T細胞反應并促進腫瘤消退。基于這些發現，一些以TIM-3為靶點的抗體正在進行臨床試驗。TSR-022是一種人源化抗TIM-3 IgG4抗體，于2016年進入I期臨床試驗(NCT02817633)旨在評估TSR-022作為單藥或聯合TSR-042(抗PD-1單抗)治療晚期實體瘤患者的安全性和有效性，初步發現高劑量聯合治療組的臨床療效其總緩解率為15%，病情穩定率為40%[61,62]。MBG453是另一種抗TIM-3單抗，目前多項臨床試驗也在評估MBG453作為單藥或與PDR001(抗PD-1單抗)聯合治療晚期惡性腫瘤患者的安全性和有效性[63]。

2.4 TIGIT 越來越多的臨床前數據表明，PD-1/TIGIT共同阻斷是一種潛在的聯合免疫治療方案。在小鼠結腸癌腫瘤模型中，盡管單獨阻斷TIGIT或PD-1/PD-L1均不能抑制腫瘤的生長，但共同阻斷TIGIT和PD-1/PD-L1可協同性地增強CD8+T細胞的活性，并延長總生存期[64]。在黑素瘤患者中，與單一阻斷相比，PD-1/TIGIT雙阻斷會增強腫瘤抗原特異性CD8+T細胞的功能[25,65]。

基于以上的研究成果，已經有多種TIGIT抗體研發進入臨床試驗階段，其中tiragolumab是目前最有潛質的藥物。在一項隨機、雙盲的II期臨床試驗中(NCT03563716)，135例未治療的、不可切除、轉移性的、PD-L1陽性的非小細胞肺癌患者分別利用tiragolumab單獨治療，或者聯合atezolizumab(抗PD-L1抗體)治療，結果顯示，聯合用藥組表現出了更高的客觀緩解率和無進展生存期[62]。tiragolumab用于治療食管癌和胃癌的I期和II期臨床試驗也在進行中(NCT03281369)。此外，還有多家制藥公司投入抗TIGIT藥物的研發，如Vibostolimab(MK-7694)、Domvanalimab(AB154)和BMS-986207等，這些藥物目前還處于初步評價的I/II期臨床試驗階段[62]。

2.5 LAG-3 阻斷LAG-3可在多種癌癥小鼠模型中恢復CD8+T細胞的活性并降低Treg細胞的抑制功能。鑒于多種腫瘤浸潤T細胞中共表達LAG-3和PD-1，LAG-3/PD-1雙阻斷的聯合治療會進一步增強抗癌療效：在一些臨床前的小鼠癌癥模型中，LAG-3和PD-1在CD4+和CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞上共表達，聯合阻斷可以協同改善T細胞的抗腫瘤反應[66]；在卵巢癌病人中，CD8+T細胞高表達LAG-3和PD-1，共同阻斷會促進腫瘤特異性CD8+T細胞的增殖和細胞因子的產生[67]。

目前，臨床試驗正在探索由LAG-3驅動的免疫應答。多個早期臨床試驗也正在測試單獨靶向LAG-3或者聯合阻斷PD-1和/或CTLA-4的治療效果。在I期的臨床試驗中，可溶性的LAG-3-Ig(IMP321)治療晚期腎細胞癌[68]和晚期胰腺癌(與化療聯合治療)[69]的研究表明，高劑量的IMP321能抑制腫瘤的生長。IMP321聯合pembrolizumab(抗PD-1抗體)治療非小細胞肺癌和頭頸部鱗狀細胞癌的臨床試驗也在進行中。另一種靶向LAG-3的藥物Relatlimab(BMS-986016)作為一線或二線治療的治療方案，在多種腫瘤中進行臨床試驗：如單獨或聯合nivolumab治療轉移性黑素瘤的II/III期試驗和聯合nivolumab和化療治療胃癌的II期試驗[62]。

因此，靶向免疫檢查點的免疫療法，如臨床上已經廣泛使用的靶向CTLA-4、PD-1和PD-L1的抗體，可以阻斷T細胞的耗竭，并使其發揮抗腫瘤的作用，已取得了顯著的療效。這也使得靶向TIM-3、TIGIT和LAG-3的臨床應用研究成為關注的焦點，未來需要更多的免疫治療臨床試驗來探索單藥或與聯合用藥對腫瘤的作用，以期更好地改善患者的臨床癥狀。

3 小結

免疫檢查點(CTLA-4、PD-1、TIM-3、TIGIT和LAG-3等)表達于免疫細胞表面，與腫瘤的增殖、侵襲、轉移及患者預后評估緊密相關，是良好的腫瘤治療靶點。鑒于其在腫瘤微環境中的高表達，抗CTLA-4、PD-1/PDL-1抗體的單藥治療或聯合治療已廣泛應用于黑素瘤、默克爾細胞癌、皮膚T細胞淋巴瘤、基底細胞癌和皮膚鱗狀細胞癌等皮膚腫瘤的臨床治療。靶向新興的免疫檢查點(TIM-3、TIGIT和LAG-3)的臨床試驗也表現出了良好的潛能，在未來可能會為皮膚腫瘤患者提供更優的治療方案。