自噬在蒽環類化療藥物心臟毒性中的作用研究進展

任昌振綜述 劉科衛審校

近年來，有效的抗癌療法極大地改善了惡性腫瘤患者的生存和預后，但也導致了多種心血管并發癥的發生[1]。蒽環類藥物(anthracyclines,AC)是一類在臨床上廣泛應用的高效廣譜抗腫瘤藥物，至今仍是治療多種惡性腫瘤的基礎化療藥物之一[2]。然而，AC可導致劑量依賴性和不可逆的心臟毒性，這成為其臨床應用的最大阻礙。目前，人們對蒽環類藥物誘導的心臟毒性(anthracyclines-induced cardiotoxicity,AIC)機制進行了大量的基礎研究，但仍缺乏有效的預防和治療手段。自噬(autophagy)是一種進化保守的細胞吞噬過程[3]，越來越多的研究證實其參與了AIC的發生。然而，自噬在AIC中的作用仍然存在爭議，激活或抑制這一過程對AIC患者是否有益并沒有明確的共識。現綜述AIC的分類和機制，重點關注自噬在AIC發生、發展中的作用并討論以調控自噬作為AIC防治靶點的潛在價值。

1 AIC概述

1.1 AIC的定義及分類 目前，根據我國“蒽環類化療藥物心臟毒性防治指南(2013年版)”，AIC的定義指具有以下1項或多項表現：(1)左心室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)降低的心肌病，表現為心臟整體功能的下降或室間隔運動的明顯降低；(2)充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)相關的癥狀，如胸悶、心悸、呼吸困難等；(3)CHF相關的體征，如第三心音奔馬律、心動過速等；(4)LVEF較基線值降低>5%且絕對值<55%，伴有CHF的癥狀或體征；或LVEF較基線值降低>10%且絕對值<55%，不伴有CHF的癥狀或體征[4]。

按照出現的時間分類，AIC可分為急性、慢性和遲發性心臟毒性：(1)急性心臟毒性發生率較低，往往出現在AC化療的數小時或數天內，對心臟造成的損傷通常是可逆的，最常見的臨床表現為心臟傳導系統的紊亂和心律失常，如復極化和QT間期改變、室性或室上性心律失常等，少數患者可表現為急性冠狀動脈綜合征、急性心力衰竭、心包炎及心肌炎等；(2)慢性心臟毒性常以累積劑量依賴性的形式發生，常出現于AC化療終止1年內，其心臟損傷常被認為是不可逆的，臨床表現為無癥狀的收縮和/或舒張性左心室功能不全，并逐漸發展為嚴重的心力衰竭；(3)遲發性心臟毒性常于AC化療終止1年后出現，并可持續數年甚至數十年，表現為心力衰竭、心肌病及心律失常等[2]。

1.2 AIC的發生機制 迄今為止，導致AIC的具體機制仍未完全明確。現有的大多數證據表明，活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的產生是AC引起心肌細胞損傷的主要原因。2014年，拓撲異構酶(topoisomerase,Top)2β被證實在AIC的發生中至關重要[5]。Top2β可在DNA復制、轉錄或重組過程中解開DNA鏈。AC通過抑制Top2β的活性引起線粒體功能障礙，并導致細胞凋亡途徑的激活和ROS的累積[5]。此外，鐵離子代謝紊亂、鈣超載、心臟炎性反應、DNA損傷應答等機制也與AIC的發生和發展密切相關[6]。在過去的十年中，隨著腫瘤心臟病學的蓬勃發展，以防治AIC為目的的不同策略被不斷開發，包括使用各種抗氧化劑，旨在阻斷AC相關的氧化應激。然而，盡管這些藥物在實驗動物模型中被證明是成功的，但它們并沒有顯示出顯著的臨床獲益[7]。抗氧化劑臨床試驗的失敗表明，除氧化應激外，AIC的發生可能還存在其他重要機制。近年來，自噬作為心肌細胞生存的重要過程，在AIC發生中的作用受到了關注。

2 自噬概述

2.1 自噬的概念和分類 自噬是在1963年由Christian de Duve教授在電鏡下觀察到細胞存在“自己吃自己”的現象后，而提出的一種用來描述細胞在溶酶體內消化胞內物質的過程。自噬是一種在真核細胞中進化高度保守的細胞生物學機制，近年來因其在心臟生理和病理中的重要作用而得到越來越多的關注。在多種心血管疾病(如心臟缺血再灌注損傷、心肌肥厚、擴張性心肌病、心力衰竭等)的發生發展過程中都證實存在自噬功能的異常[8]。換言之，自噬是在細胞受到應激刺激后，為維持細胞內穩態，將受損的細胞器、錯誤折疊或聚集的蛋白質及外來病原體等運送至溶酶體降解清除的過程。

根據細胞內降解底物傳遞到溶酶體方式的不同，自噬主要分為3種類型：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)[9]。巨自噬是自噬中最常見的類型，其特征是形成一種獨特的稱為自噬小體的雙層膜細胞器，將細胞內物質運送至溶酶體內降解；微自噬是指溶酶體通過溶酶體膜的內陷直接吞噬細胞內物質的過程；而伴侶介導的自噬，其特征是含有KFERQ序列的蛋白與伴侶蛋白(如熱休克蛋白70等)結合，后者以溶酶體相關膜蛋白2A依賴的方式將靶蛋白運輸到溶酶體降解的過程[10]。自噬曾被認為是一種非選擇性的過程，但近年來研究發現，自噬也可以選擇性地降解細胞內物質，如受損的線粒體、核糖體、內質網、溶酶體、過氧化物酶體等細胞器及細胞內的異源物質如微生物等。因此，根據選擇性降解底物的不同，自噬又可分為：線粒體自噬(mitophagy)、核糖體自噬(ribophagy)、內質網自噬(reticulophagy)、溶酶體自噬(lysophagy)、過氧化物酶體自噬(pexophagy)和異源自噬(xenophagy)等[11]。

2.2 自噬的生物學過程和調控機制 巨自噬是細胞響應環境和生理信號的主要調控形式，也是自噬過程中最具特征性的表現形式。在本文中重點關注巨自噬(以下簡稱自噬)的形成過程。自噬發生的過程涉及復雜的膜動力學，實質是亞細胞膜重新排列的過程。自噬的步驟可以分為自噬小體的起始、延伸、形成、成熟和降解5個關鍵階段。在膜重排的過程中，會形成具有獨特雙膜結構的囊泡，將部分細胞質和細胞器隔離，稱為自噬小體。隨后，自噬小體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，并利用其中一系列溶酶體降解酶(如組織蛋白酶和其他酸性水解酶)對隔離的物質進行蛋白質水解。消化后的內容物被重新釋放到胞質中，在生物合成途徑中進行循環再利用。

自噬過程中的調控機制是十分復雜的，涉及多個由進化保守的自噬相關基因(autophagy-related genes,ATG)編碼的蛋白質與其他自噬調節因子的協調作用。迄今為止，已鑒定出至少40個以上的ATG參與了自噬不同階段的調節。在這些ATG中，有18個基因(ATG1～ATG10,ATG12～ATG14,ATG16～ATG18,ATG29和ATG31)編碼的蛋白是自噬小體形成所必需的，被稱為自噬核心基因[12]。ATG蛋白家族在自噬不同階段與其他自噬調節因子的相互作用，主要是通過蛋白質水解和蛋白質翻譯后修飾實現的，包括磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化、乙酰化和脂化等[13]。例如，在哺乳動物中，由ATG13與絲氨酸—蘇氨酸激酶Unc-51-line激酶1(ULK1)和200 kD復合物的黏著斑激酶家族相互作用蛋白(FIP200)共同形成的復合物，是自噬啟動所必需的[14]。而由ATG3、ATG4、ATG7、ATG10和ATG16參與形成的ATG12-ATG5和微管相關蛋白輕鏈3(light chain 3,LC3)—磷脂酰乙醇胺2個泛素樣偶聯系統，在自噬小體的延伸及形成階段發揮重要作用[15]。此外，自噬也同時受到許多其他信號通路和介質的調控，其中腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路構成了自噬的調節核心通路[16-17]。大量研究表明，AMPK和mTOR信號通路分別發揮促進和抑制自噬的作用。其中mTOR主要受磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR通路的上游信號調控[18]。更具體地說，細胞內或細胞外應激可以激活PI3K受體，進一步催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸轉化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)。在與磷酸肌苷依賴性激酶1的共同作用下，PIP3進一步激活Akt。被激活的Akt會上調mTOR活性，后者通過使ULK1失活進而抑制自噬的啟動[18]。相反，當機體缺乏營養或能量時，一磷酸腺苷(AMP)/ATP比值的增加可以激活AMPK，從而抑制mTOR的活性，削弱其對ULK1的抑制作用，最終啟動自噬[17]。mTOR作為自噬調控的傳感器，接收來自不同上游信號分子的信息，進而調控下游信號分子，包括p70S6K、ULK1和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(PGC-1α)等，發揮各自的生物學效應[19-20]。因此，mTOR活性的絕對增減是由各種因素或刺激的比例決定的。自噬調控可能涉及mTOR的同時激活和抑制，這取決于哪種調節因子占主導地位。

2.3 自噬的生物學功能 自噬作為一種嚴格調控的分解代謝過程，介導細胞內物質的降解和循環，對維持體內穩態和細胞生存發育至關重要。例如，神經細胞中ATG基因的缺失會導致神經退行性變和泛素陽性聚集物的積累，而ATG基因在肝臟中的缺失則會導致肝腫大和肝功能障礙[21-22]。正常情況下，大多數細胞發生較低的基礎水平自噬，清除受損和多余的細胞器、錯誤折疊的蛋白質和入侵的病原體。而在缺氧、饑餓和氧化應激等惡劣條件下，自噬過程被認為是一種內源性防御機制，使細胞的生存能力增強[23]。自噬增強的轉基因小鼠在心臟和腎臟纖維化及自發腫瘤發生等表型方面有明顯改善，并且可以比正常小鼠存活得更長[24-25]。在線蟲中的研究證明，自噬通路對大多數長壽狀態(如熱量限制)是必不可少的[23]。自噬可能通過改善蛋白質和細胞器質量控制、促進基因組穩定性等方面來促進長壽。除了對細胞生存的促進作用，自噬還可以調節多種細胞通路，包括腫瘤的抑制和促進、炎性反應和免疫反應等[26]。雖然基礎水平的自噬對維持細胞內環境穩定是必要的，但當自噬過度激活并超過一定閾值時，就會導致一種特殊類型的細胞程序性死亡，又被稱為細胞的自噬性死亡(autosis)[27]。

3 自噬在AIC中的作用

心臟自噬在AIC中的作用一直存在爭議。一些研究發現AC化療誘導自噬，進而加劇心臟毒性，而其他研究表明自噬具有保護和預防AIC的作用。現總結關于AC調控自噬研究中相互矛盾的觀點，并討論這些矛盾結論的可能原因。

3.1 AC過度激活自噬導致AIC發生 目前大多數學者認為，AIC的發生是由于AC治療中過度激活了心肌細胞的自噬過程，形成了過多的自噬溶酶體，導致心肌細胞在降解受損細胞器和胞內錯誤折疊蛋白的同時，損傷了細胞內正常的物質，引起心肌細胞自噬性死亡，并進一步介導了心臟重塑。早期多項國內外關于AIC的研究為這一理論提供了支持。2009年，Lu等[28]首次報道了AC能夠刺激自噬標志物Beclin1(酵母菌ATG6的同源物)的生成，并通過電鏡觀察到心肌自噬小體數目的增多。黃潔等[29]也通過構建AIC模型發現AIC模型組小鼠心肌組織內的Beclin1和LC3-Ⅱ(自噬小體形成的另一個關鍵標志物)水平較對照組明顯增加。Kobayashi等[30]通過構建Beclin1過表達模型，發現Beclin1過表達后可進一步加劇AC誘導的心肌細胞死亡，而抑制Beclin1蛋白可阻斷自噬激活并減少AC導致的心肌細胞死亡。基于這種理論，吳昂等[31]發現自噬抑制劑氯喹可以提高不同濃度AC作用下心肌細胞的存活率，并推測可能與其抑制了Beclin1的表達水平有關。后來進一步的研究又發現，除了Beclin1和LC3-Ⅱ外，AC治療還可導致心肌細胞內其他多個不同自噬相關標志物的高表達，如ATG5、ATG7、p62等[32-35]。安慧仙等[36]在探尋AIC保護藥物的研究中發現，能夠通過抑制自噬減輕AC的心臟毒性。總的來說，這些研究指出自噬的激活是AC引起心肌細胞程序性死亡的主要原因，并根據這一觀點，提出抑制自噬可能是防止AIC發生的一種有效手段。

3.2 AC抑制自噬功能導致AIC發生 有學者提出了與上述相反的觀點，認為AC治療過程中自噬相關標志物的升高是自噬被抑制后出現的累積效應，本質是AC破壞了心臟自噬流的動態平衡，導致心肌細胞對外界環境刺激的保護機制受損，同時細胞對自身衰老細胞器和錯誤折疊蛋白的處理能力下降，使已經形成的自噬小體不能夠被有效及時降解而產生堆積，從而觸發了心肌細胞凋亡，并逐步發展為AIC。研究發現，AC能夠抑制自噬啟動的上游正調控因子AMPK的磷酸化，提示AC可通過抑制自噬的啟動來降低自噬水平，而通過預先饑餓處理啟動自噬后再給予AC干預，發現可恢復細胞AMPK信號傳導和心臟自噬水平，并減輕了AC誘導的心臟收縮功能障礙[37]。基于這一理論，Sishi等[38]通過應用自噬誘導劑雷帕霉素對AC處理后的大鼠心肌細胞進行干預，發現雷帕霉素激動自噬后反而明顯降低了AC的毒性，提高了心肌細胞活力。與此同時，其他研究也發現在AC處理后心肌自噬被抑制，LC3和p62會積累性增加[39-40]。這些研究與先前的結論截然相反，為自噬在AIC中的作用帶來了新的視野。近期另一項研究又進一步對AC引起的自噬通量改變進行了動態觀察和分析，提出可能是由于AC抑制了溶酶體上H+-ATP酶活性，進而導致溶酶體酸化受損，使自噬小體與溶酶體融合受阻而不能降解底物，從而引起Beclin1、LC3-Ⅱ和p62等自噬標志物的堆積[41]。因此，AC除了抑制自噬啟動外，似乎還影響自噬的后續步驟，如底物的降解。最近一項旨在篩選AIC保護藥物的研究中，通過構建AIC斑馬魚模型，也證實了AC對心臟自噬的抑制作用，而恢復自噬則能改善心臟功能[42]。綜上，這些研究從各個方面顯示出AC對自噬功能的抑制和破壞，并提出自噬通量的修正可以減輕AC引起的心臟損傷。

3.3 自噬在AIC中作用存疑的可能原因分析 AC是否增加或抑制自噬及自噬在AIC中是否有益仍存在爭議。目前的這些基礎研究得出了完全對立的結論，綜合分析可能存在以下原因。首先，在模型的構建方面，使用不同種屬的動物模型、體內和體外模型及急性和慢性模型，都可能導致結論的不同。在這方面，哺乳動物整體層面的慢性低劑量AC毒性模型更接近臨床情況，得出的結論可能也相對更為可靠。其次，評價自噬功能的時間點和檢測手段的不同也可能導致不同的結果。如前所述，自噬是一個動態降解胞內物質再利用的循環過程，不同時間點的取材也許僅能發現自噬在某一階段的變化。而相較于檢測自噬標志物如LC3-Ⅱ、Beclin1、p62等蛋白水平變化的傳統方法，通過應用RFP-GFP-LC3雙熒光腺病毒轉染直接動態觀察自噬流的手段則更為精準[43]。此外，有些研究沒有進行自噬通量的分析，在這種情況下，簡單觀察自噬標志物的表達水平變化可能會導致錯誤的結論。最后，回歸到自噬的本身，生理水平的自噬是保護性的，而過度激活的自噬可能是損傷性的。因此，在腫瘤存在的復雜背景下，自噬在AIC中也可能發揮雙重作用，這可能取決于自噬激活的水平及自噬與其他生理和病理過程之間的相互作用。最近的一項研究通過對AIC斑馬魚模型及小鼠模型進行表型分析，發現自噬在AIC中存在一種雙相反應：早期激活，后期抑制。該研究進一步證實，基于ATG7(編碼限速自噬核心蛋白)的自噬激活在AIC的后期能夠產生心臟保護作用，而在早期激活自噬則會加劇AC的心臟毒性，這在一定程度上凸顯了靶向自噬治療的時間依賴性特點[44]。

4 小結與展望

越來越多的證據表明，自噬在心臟生理和病理過程中起著重要的作用。與此同時，自噬也已經成為一種很有前景的癌癥治療靶點。目前臨床廣泛使用的AC改變了癌細胞和/或心肌細胞的自噬水平，使得自噬在AIC中起著重要作用。然而，心臟疾病體內、體外模型的局限性和復雜性一直困擾著這一領域，導致文獻中充滿了相互矛盾的結果。自噬在AIC中是激活還是抑制、激活或抑制自噬后AIC如何發展、如何靶向調控自噬預防AIC的發生，這些問題都有待于進行更廣泛的研究來證實。闡明自噬這一生物學過程在AIC中的作用將有助于預防或治療化療引起的心臟毒性。此外，未來靶向自噬的抗腫瘤藥物的研發還需要警惕心臟毒性的發生，特別是與其他已知影響自噬水平的藥物聯合使用時，更要加強對心臟功能的監測。隨著生物信息學的不斷發展，必須利用最先進的實驗策略來確定自噬通量在化療應激心肌細胞中的功能作用。更為嚴格的自噬檢測和評價方案，對于闡明這些復雜的生物學問題，以實現提高臨床療效和減少心臟毒性發生至關重要。