牙髓干細胞多項分化潛能的研究及應用進展

夏亮，江文欣，鄒多宏

(1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院 a.口腔顱頜面科，b.口腔外科，上海 200011; 2.上海交通大學口腔醫學院，國家口腔醫學中心，國家口腔疾病臨床醫學研究中心，上海市口腔醫學重點實驗室，上海 200011; 3.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院口腔科，上海 200011)

干細胞被定義為可產生一種或多種特殊細胞類型的具有克隆性、自我更新性的原始細胞，在組織發育、維持穩態和修復受損組織等過程中均發揮重要作用[1]。干細胞分為三大類：多能誘導干細胞、胚胎干細胞和成體干細胞。其中，成體干細胞包括間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)、造血干細胞、表皮干細胞、脂肪干細胞、神經干細胞、角膜緣干細胞和肝干細胞等[2-8]。

MSC是具有多項分化潛能的多能細胞[9]，存在于成人骨髓基質中，為紡錘形的成纖維細胞樣細胞，具有復制為未分化細胞的能力，并且能夠進一步分化為多種間充質來源的組織，包括肌肉、肌腱、脂肪、軟骨、骨和骨髓基質等[9]。除骨髓外，從脂肪組織和臍帶血中也可以獲得類似MSC的種群[10-11]。脂肪組織和骨髓是最容易獲得MSC的來源，具有相對豐富的祖細胞[12]。骨髓MSC可改善組織損傷，具有改善肺損傷、腎臟疾病、糖尿病、心肌梗死、肝損傷和神經系統疾病的功能。然而，與脂肪MSC相比，骨髓MSC具有更高的分化成軟骨和成骨譜系的能力[12]。此外，MSC還具有肌源性、神經源性和腱源性譜系分化的能力。隨著對MSC研究的不斷深入，在人體的每個器官和組織中都發現了多種干細胞，其中包括來自口腔和牙齒組織的MSC[13]。研究發現，牙源性MSC同樣具有成骨、成軟骨、成脂、成神經等分化潛能，并且具有更強的牙源性分化潛能。現就牙源性MSC的特性及其在牙齒、骨骼、軟骨、脂肪和神經再生中的分化潛力和組織工程應用前景進行綜述。

1 牙髓干細胞多項分化潛能

2000年，Gronthos等[14]首次報道從第三磨牙的牙髓組織中分離和鑒定出了MSC，即牙髓干細胞(dental pulp stem cell,DPSC)。目前，研究人員已能通過不同的口腔組織干細胞，如人脫落乳牙干細胞、牙周膜干細胞、牙濾泡祖細胞、頂端乳頭和牙齦組織MSC等[13]，獲得各類MSC種群。口腔MSC具有體外多能性，它們可以向多種細胞群分化，如成牙本質細胞、成骨細胞、軟骨細胞、成肌細胞、成纖維細胞、神經細胞、脂肪細胞和內皮細胞等[15]。

牙髓是一種非礦化組織，由結締組織、血管淋巴和神經組成，位于牙齒中央的髓腔。牙髓含有不同類型的細胞，包括成牙本質細胞、成纖維細胞、成骨細胞、破骨細胞、神經元和內皮細胞[16]。DPSC是外胚層衍生的干細胞，起源于神經嵴，從胚胎第6周起外胚層和外胚間充質相互作用開始形成牙齒，在這個過程中部分原始的MSC包裹在牙髓的前期結構內，這些是DPSC的來源。DPSC具有MSC特性，形態似成纖維細胞，可黏附于塑料表面，體外培養時可形成集落。DPSC表達間充質標志物，如CD29、CD44、CD59、CD73、CD90、CD146等，而不表達CD34、CD45、CD11b等造血標志物[15]。DPSC與骨髓MSC的性質相似，表達與礦化相關的表面標志物和基質蛋白，包括堿性磷酸酯、骨鈣蛋白和骨橋蛋白等[17]。與骨骼不同，牙齒組織不會經歷持續性的重塑過程，因此DPSC較骨髓MSC具有更大的分化潛能[13]。

DPSC具有多譜系分化的潛能，在適當的誘導條件下，可以分化為成牙本質細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和神經樣細胞[16]。Alge等[18]研究比較了DPSC和骨髓MSC的克隆形成、增殖率、集落形成和礦化潛能，結果顯示，DPSC具有更高的增殖速率、更強的克隆形成、更多的干細胞表型表達及更高的礦化潛能。

1.1DPSC成骨分化 先天性和獲得性骨缺損的修復是再生醫學研究的重點。近年來，利用骨髓干細胞治療骨組織缺損已成為研究熱點并取得了突破性進展[19]。DPSC作為牙源性的MSC，具有與骨髓MSC相似的增殖和分化潛能，在特定刺激條件下增殖并定向分化為骨組織。

在培養基中加入抗壞血酸、地塞米松、β-甘油磷酸和胎牛血清，可誘導DPSC的成骨分化，DPSC分化形成的成骨細胞在表型和功能上與正常原代成骨細胞相似[20]。經過成骨誘導后，DPSC中Runt相關轉錄因子2 和鋅指轉錄因子表達顯著增加，產生細胞外鈣化的骨樣基質結節，這些骨基質樣結節堿性磷酸酶和茜素紅染色呈陽性，說明DPSC經過誘導可以有效地分化為功能性成骨細胞，并生成鈣化的含羥基磷灰石的細胞外基質[17]。近年來，學者們基于動物實驗模型和生物支架材料對DPSC的骨再生應用潛能進行了廣泛的研究。將DPSC進行骨誘導后獲得的編織骨，異位移植到免疫功能缺陷動物模型中，能夠誘導生成具有完整血液供應的成熟骨組織[21]。同時，有效地使用支架材料可以優化所形成的骨組織的3D結構并增強DPSC的成骨細胞分化。目前，多種材料已成功地用作DPSC成骨誘導的載體，包括3D明膠支架、自組裝可生物降解的肽納米纖維水凝膠、磷酸鈣/聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架、顆粒狀羥基磷灰石/磷酸三鈣陶瓷支架、天然支架(如生物珊瑚)和殼聚糖/膠原蛋白等[20]。在國外的臨床研究中，7例患者使用了膠原蛋白支架移植DPSC修復下頜骨缺損，經過術后3年的隨訪，獲得了明顯的治療效果[22]。

有效的信號轉導在刺激新骨形成和發育中起著至關重要的作用。有效獲取和局部遞送自體血漿生長因子為增強DPSC骨誘導和骨再生提供了一種強大的工具。富血小板血漿、富血小板纖維蛋白和富血漿生長因子為刺激和功能分化具有再生潛能的原代DPSC提供了生物因子富集型培養基，研究發現富血小板血漿和富血漿生長因子可以成功誘導人脫落乳牙干細胞、DPSC和牙周膜干細胞增殖，并增強其成骨分化[23]。另外，研究表明重組人骨形態發生蛋白2可以增強DPSC在牙槽突骨缺損動物模型中的成骨分化，目前重組人骨形態發生蛋白2已獲批準并已廣泛用于牙科手術的上頜竇提升手術[24]。盡管有大量的證據證實了基于DPSC的骨再生新型技術的效果，但由于不斷變化的監管框架、標準化干細胞生產規范的缺乏、學術研究與工業生產的銜接不足以及缺乏長期臨床隨訪等問題，DPSC作為骨再生的組織工程工具應用于臨床仍存在許多阻礙。

1.2DPSC牙源性分化 50%的牙齒缺失是由于齲齒和根折導致。目前，根管治療和修復是治療牙髓炎癥和重建缺損牙體組織最主要的治療手段。然而，由于根管治療后牙齒喪失了牙髓神經和血管的滋養，根折和牙齒喪失的可能性大大增加，牙髓損傷的再生修復已成為功能性牙齒恢復的目標。

Gronthos等[14]在2000年首次證明了DPSC分化為成牙本質細胞的能力，將DPSC復合的羥基磷灰石/磷酸三鈣支架移植到免疫缺陷鼠的真皮下，可以形成牙髓樣組織和成牙本質細胞樣管狀牙本質，表明牙本質發生分化是在DPSC表型中建立的主要或默認程序之一。將人脫落乳牙干細胞中提取的DPSC利用可注射支架材料重組膠原注入牙髓腔，不僅可以保持生命活性，還能夠重建血管化的牙髓組織，并具有分化為成牙本質細胞的能力，這些細胞可以表達新的牙本質涎磷蛋白和牙本質基質蛋白[25]。結合臍靜脈內皮細胞的DPSC與重組膠原支架復合，可以進一步增強牙髓樣組織的血管化和血管生成[26]。

無牙髓牙齒的牙髓再生療法是目前研究的關注重點，通過組織工程學方法進行牙髓再生的治療正在進行廣泛的臨床試驗研究，目前仍存在許多問題，包括牙髓再生的時間過長、支架材料的使用增加了炎癥和感染的風險等。DPSC無支架3D細胞構建體建立的新穎牙髓再生療法技術避免了支架材料在移植牙髓樣組織中造成的潛在問題。Itoh等[25]通過體外和體內實驗分別評估了3D DPSC構建體用于牙髓再生的可行性。體外研究中，通過用熱響應性水凝膠成型DPSC的片狀聚集體來獲得3D DPSC構建體，經過長時間的培養，構建物中的DPSC仍然能夠保持活性，且該3D DPSC構建體具有充當移植組織所必需的自組織能力。在人牙根管中填充3D DPSC構建體并將其植入免疫缺陷小鼠的皮下6周后，根管內形成了具有豐富血管的牙髓樣組織[25]。組織學分析表明，移植的DPSC構建體在與牙本質接觸的部位分化為成牙本質細胞樣礦化細胞，并且能夠在不需要支架或生長因子的情況下形成富含血管的牙髓樣組織。這項技術的建立和發展能夠制備可變大小和形狀的DPSC結構，表明DPSC構建體的移植有望在無牙髓牙齒中再生牙髓組織。

1.3DPSC成脂分化 脂肪細胞由MSC定向分化而來，脂肪生成的改變參與了多種復雜疾病(如骨質疏松癥、肥胖、糖尿病)和其他脂肪代謝紊亂等的發生，脂肪干細胞治療為人類組織器官缺損、年輕化等治療提供了新思路。

研究證實了DPSC成脂分化的能力[9]。向含有胎牛血清的培養基中加入異丁基甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、慶大霉素等均可誘導DPSC的成脂分化[26]。從第三磨牙中提取的DPSC在完全間充質成脂培養基中培養可以獲得脂肪細胞，這些細胞Oil-Red-O陽性染色，表達早期和晚期脂肪細胞特異性基因，反轉錄聚合酶鏈反應驗證得到過氧化物酶體增殖物激活受體A2和轉錄因子AP2的表達，進一步證明了DPSC的成脂活性[27]。Lei等[28]的研究進一步描述了DPSC在體內移植后的特性，從DPSC異位移植的體內生成的牙髓樣細胞中再次分離可重新獲得DPSC(re-DPSC)，re-DPSC依然表達間充質標志物和MSC標志物等，如基質細胞抗原1、CD29、CD90、CD105和CD146等，此類細胞依然具有分化為脂肪細胞和軟骨細胞的潛能，并具有沉積礦物質能力。具備良好脂肪生成潛能的DPSC成為誘導脂肪干細胞的另一供體組織，為DPSC來源的脂肪干細胞再生治療研究奠定了基礎。

1.4DPSC軟骨向分化 關節軟骨是一種具有一定厚度、高度組織化的結締組織，位于活動關節的末端，在關節的運動和關節穩定中均起著重要作用。關節區域的急慢性損傷、軟骨退化、骨關節炎等均可造成關節軟骨的不可逆性損傷。關節軟骨中無血管、神經的分布，軟骨細胞是關節軟骨中唯一的細胞，代謝活性較低，當關節軟骨發生損傷時，進行自我修復的可能性非常小。

Wei等[29]在2007年首次描述了DPSC軟骨分化的過程，將DPSC培養在添加胎牛血清、轉化生長因子-β1、地塞米松、胰島素、抗壞血酸2-磷酸酯和丙酮酸鈉的α-MEM(alpha-minimum essential medium)培養基中孵育3周，可以得到成功獲得軟骨向分化的DPSC。在人肋軟骨細胞中加入DPSC可以有效修復關節缺損，軟骨細胞能夠提供軟骨誘導性，促進DPSC向軟骨分化，增強軟骨的形成[30]。使用紫外線輔助的光刻技術制造的聚乙二醇二甲基丙烯酸、甲基丙烯酸明膠和羥基磷灰石組成的復合聚乙二醇-甲基丙烯酸明膠-羥基磷灰石水凝膠可以作為DPSC納米結構支架，該支架結構能夠支撐DPSC形成三維球體，為體外誘導軟骨分化形成提供了合適的環境[31]。

體內實驗也驗證了DPSC在動物模型中的軟骨形成能力[32-33]。Tsutsui[26]將來自乳牙的DPSC通過流式細胞儀進行表征篩選后培養擴增，與Ⅰ/Ⅲ型膠原生物材料支架復合的DPSC可以對巴西小型豬髁突直徑6 mm的全厚度軟骨缺損模型進行修復，術后6周透射電子顯微鏡檢查顯示，在髁突表面形成了完整的軟骨膜和散在的微絨毛狀結構。DPSC與支架材料的復合在修復軟骨形態缺損上具有顯著優勢，組織學上DPSC支架可以形成豐富的細胞層次，成纖維組織的形成數量也有所增加。Mata 等[33]研究表明，在軟骨形成培養基中培養DPSC和原代分離的兔軟骨細胞，可以檢測到膠原蛋白Ⅱ和聚集蛋白聚糖的表達。將兩種細胞分別與3%藻酸鹽水凝膠復合后，植入軟骨損傷的兔模型中，術后3個月可以觀察到兩組均存在軟骨再生，DPSC組軟骨再生強于原代軟骨細胞組。

盡管這些結果是初步的，但它們表明DPSC可能成為潛在的新型關節軟骨再生的組織工程原材料，有望作為組織再生中基于干細胞療法來修復關節缺損的適用組織工程細胞。

1.5DPSC神經分化 神經元變性、功能喪失是帕金森病、阿爾茨海默病、脊髓損傷、周圍神經損傷和腦卒中等的共同特征，延遲神經元變性進程是治療此類疾病的有效途徑。在過去10年的發展中，干細胞療法成為此類疾病的潛在療法。神經干細胞具有自我更新和分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等的能力，是干細胞療法的理想來源。成年人的神經干細胞位于兩個主要位置[34]：海馬回亞區和側腦室的腦室下區，然而該區域的神經干細胞難以通過手術大量獲得。

DPSC起源于神經嵴細胞，表達多種神經嵴細胞發育相關基因及神經干細胞標志物巢蛋白等，巢蛋白陽性的DPSC具有分化為神經元細胞的潛力。此外，DPSC表達少量成熟中樞神經系統的表面標志物，包括神經元標記微管相關蛋白2、神經絲、βⅢ-微管蛋白、少突膠質細胞相關2′,3′環核苷酸-3磷酸二酯酶和星形膠質細胞膠質纖維酸性蛋白等[35]。

近年來，多項體外研究證明了DPSC的神經元分化能力[35-36]。DPSC可在體外表達神經生長因子、腦源性神經營養因子和神經膠質細胞源性神經營養因子信使RNA，進而促進多巴胺能神經元的活性和表型特征，并保護多巴胺能神經元免受體外神經毒素6-羥基多巴胺的侵害。在堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和表皮生長因子的誘導下，DPSC可以神經球樣細胞的形式生長，分化的DPSC顯示出神經元樣的形態，表達膠質纖維酸性蛋白、神經絲和βⅢ-微管蛋白。bFGF是DPSC神經源性分化的重要生長因子，在存在bFGF的情況下，DPSC的神經球大小增加，神經源性標志物表達上調，然而，FGF受體抑制劑能夠消除bFGF誘導的DPSC神經元分化。bFGF可能參與調控DPSC神經向分化的發生機制。DPSC的神經源性分化能力受Wnt信號相關蛋白表達調控，激活Wnt信號通路可以有效促進DPSC的神經源性分化并誘導表達更高水平的神經源性標志物，Wnt/β聯蛋白信號轉導在DPSC的神經分化中起重要作用[37]。在不含胎牛血清的1 μmol/L巰基乙醇標準培養基中培養24 h，能夠誘導DPSC分化為施萬細胞，這些細胞在凍存之后依然保持其神經方向分化的生物學性能，這種潛力提示DPSC有望用于組織工程和干細胞的治療[38]。

2 DPSC再生醫學前景

DPSC在再生醫學領域有巨大的應用潛力，并已用于胰腺、心臟和角膜研究。將DPSC分化為類似于胰島細胞的胰島細胞聚集體，DPSC衍生的胰島細胞聚集體二硫酮染色陽性，表達C肽、胰十二指腸盒因子1、配對盒轉錄因子4、配對盒轉錄因子6、神經源素3和胰島素增強結合蛋白1，并且能夠在葡萄糖誘導下釋放胰島素[38]。這些初步結果表明，DPSC可能成為糖尿病的潛在治療方式之一。Gandia等[39]發現DPSC能夠分泌促血管生成因子和抗凋亡因子，能夠有效修復裸鼠誘發的心肌梗死。心肌干細胞注射后4周，DPSC便可以實現體外擴增、改善心臟功能，DPSC可能作為急性心肌梗死心臟修復的新型替代細胞療法。DPSC與角膜緣干細胞具有相似的特征，在角膜緣干細胞缺乏癥的動物模型中移植組織工程化的DPSC可以成功重建角膜上皮[40]。總之，DPSC在再生醫學中發揮著關鍵作用。

再生牙髓新型支架的開發是再生牙科領域牙科材料研究的重要新領域，基于支架的組織工程技術為替換受損牙齒并恢復生物學功能提供了廣闊的應用前景。將DPSC植入具有納米羥基磷灰石的電紡聚ε-己內酯/明膠支架可以上調特定牙源性基因的表達，增強DPSC在體內向成牙本質細胞樣表型的分化[41]。水凝膠由于其良好的生物學特性而被廣泛研究為組織工程支架[42]，基于乙二醇甲殼質的可降解熱響應水凝膠支架在室溫下為溫和的黏性溶液，但在生理條件下可迅速轉變為耐用的水凝膠，可以維持DPSC的增殖和牙源性分化，有望成為牙本質再生的理想組織工程支架材料。

3 小 結

DPSC具有分化為不同細胞譜系的能力，是再生醫學的寶貴資源。骨和軟骨分化譜系可以為骨/軟骨相關疾病的治療領域提供有效的替代治療方法。來源于牙髓并基于DPSC的組織工程化3D構建支架干細胞培養技術在軟骨組織再生方面有巨大的潛力。DPSC的脂肪分化潛力為心臟代謝性疾病、糖尿病、肥胖相關疾病等不同研究領域的發展提供了新的契機。DPSC的神經分化有助于幫助研究許多神經退行性疾病，例如阿爾茨海默病、帕金森病、腦卒中、脊柱脊髓損傷、周圍神經損傷等，移植的DPSC能夠通過神經營養機制保護并減少神經元損傷，干細胞移植可能成為恢復神經功能的有效治療方法。

隨著3D打印技術的進步和創新，在支架引導下的DPSC向骨骼、軟骨、脂肪組織或神經組織分化，進一步分化成特定組織或器官，為多種疾病創造出新的替代治療方案，可能在未來的再生醫學中產生無限的應用前景，DPSC的研究使組織工程和再生醫學領域均向前邁進了一步。