INSL3在女性生殖調節中的作用研究進展

陳甜，陳卓，楊婧

(1.貴州醫科大學，貴陽 550004； 2.貴州省人民醫院婦產科，貴陽 550004)

胰島素樣肽(insulin-like peptides，INSL)3、INSL4等肽激素的共同點在于其可作為分泌肽被合成，這類肽結構包括3個肽域，即N端的B域、中間的C域和C端的A域，其中B域和A域非常保守，兩者可形成相同且相對剛性的三維骨架[1]。有證據表明，松弛素和INSL的C域大部分被切除，且無論C域是否存在，松弛素和INSL肽均保留了完整的生物活性[2-3]，主要原因為C域在肽與物種之間的差異較大，在結構上相對靈活，不會與受體結合。除松弛素H1、松弛素H2外，還有部分INSL家族成員(如INSL3、INSL4)也與生殖生理學相關，包括睪丸下降、哺乳、妊娠和分娩等[3]。人絨毛膜促性腺激素、催產素以及INSL也被稱為“新激素”，主要通過促性腺激素和類固醇等系統調節內部受精和妊娠相關生理功能[4]。INSL3最初在豬和小鼠中作為一種獨特的睪丸特異性基因轉錄物序列被發現[5]。目前哺乳動物INSL3的主要合成位點在睪丸間質細胞[6]。INSL3通常被認為是一種雄性特異性激素，但也在雌性哺乳動物竇卵泡的類固醇膜內細胞及黃體中表達[7]。現就INSL3在女性生殖調節中的作用予以綜述。

1 INSL3信號通路及生理功能

1.1INSL3受體 INSL3在結構上與松弛素密切相關，其同源受體為G蛋白偶聯受體7，亦稱為松弛素家族肽受體(relaxation family peptide receptor，RXFP)2。編碼RXFP2的基因包含18個外顯子，除表達為全長功能的受體外，還可表達為多種長度的剪接變體，但這些剪接變體的生物學功能目前尚未明確[8]。RXFP2的主要特點是1個大的胞外域，其中N端包含1個低密度脂蛋白-A模塊，然后是10個富含亮氨酸的重復序列，最后是1個富含半胱氨酸的鉸鏈區連接第一個跨膜域[1]。研究表明，INSL3主要通過激素B鏈內的殘基與RXFP2富含亮氨酸的重復序列表面的氨基酸相互作用，且這種作用具有較高的特異性與親和力，因此包含B結構域的INSL3二聚體分子只能作為RXFP2受體拮抗劑，因為INSL3二聚體與RXFP2相互作用不會導致RXFP2激活[9]。體內的INSL3與RXFP2結合可導致胞外域向下彎曲，從而啟動低密度脂蛋白-A、INSL3的A鏈與7跨膜區結合，調控下游信號通路[10-11]。雖然高水平松弛素H2也可在體外激活RXFP2，但在體內松弛素生理水平幾乎不可能激活RXFP2，因此在體內INSL3與RXFP2相互作用的特異性較高[10]。過表達RXFP2后，INSL3啟動的主要第二信使為興奮性G蛋白，而興奮性G蛋白激活可導致腺苷酸環化酶產生環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，進而激活β聯蛋白并刺激磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B信號通路，進一步激活Wnt和Notch通路的下游信號[10，12]。

研究顯示，RXFP2基因在牛卵巢內膜細胞和卵母細胞以及黃體中均有表達，但在顆粒細胞或卵丘細胞中未見明顯表達；通過刺激牛竇狀卵泡中的cAMP表達可調控INSL3，在牛黃體細胞中也可通過增加孕酮水平達到類似的效果[13]。另有研究表明，大鼠卵母細胞中的RXFP2可能以連鎖方式參與卵母細胞的成熟過程[14]。在牛子宮內膜以及人子宮肌層中均發現RXFP2基因表達，但在人子宮肌層細胞中并未發現cAMP對INSL3的調控作用[13]。RXFP2與RXFP1在人肌瘤組織中均有表達，且大鼠平滑肌瘤ELT-3細胞中的INSL3表達可導致轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導的Smad2磷酸化作用減弱，表明INSL3可能具有抗纖維化作用[15]。RXFP2基因也表達于大鼠子宮肌層和子宮內膜，當子宮血流受限時其表達增加[16]。此外，RXFP2轉錄本在早期植入前胚胎中的表達也顯著增加[16]。

1.2INSL3-RXFP2通路的生理學功能 RXFP2僅在大鼠竇前卵泡的卵母細胞中表達，而INSL3可通過誘導卵母細胞產生生長分化因子9、刺激膜雄激素受體的產生等作用于竇前卵泡，從而誘導卵泡生長[17]。在牛竇狀卵泡中，即使不存在黃體生成素(luteinizing hormone，LH)水平顯著升高，也會表達RXFP2受體，而RXFP2不僅可調控INSL3的表達，還會導致cAMP表達增加[18]。研究表明，INSL3-RXFP2通路對竇卵泡功能的調節具有較大影響，低劑量(約0.1 ng/ml)的LH在體內可導致卵泡內膜細胞INSL3表達上調，高劑量(>1 ng/ml)LH可導致INSL3表達下調，而內膜細胞分泌的INSL3表達水平的變化可誘導17α-羥化酶表達，17α-羥化酶則負責孕烯醇酮或孕酮中卵泡類固醇前體雄烯二酮的產生[19]。用INSL3或其受體RXFP2的干擾小RNA處理內膜細胞，可導致依賴17α-羥化酶的雄烯二酮的產生途徑被完全抑制，同時雄烯二酮被生長中的竇卵泡的顆粒細胞吸收，雄烯二酮可作為卵泡刺激素活化的芳香酶產生雌激素(雌酮、雌二醇)的主要前體，而雌二醇可通過雌激素受體α或雌激素受體β上調內膜細胞INSL3的表達；卵泡內膜細胞中雌激素的作用模式可能并不是經典模式，因為在INSL3基因啟動子附近并未發現雌激素反應元件，而雌二醇可能通過類固醇生成因子1成為對INSL3發揮作用的關鍵因素；在INSL3-RXFP2通路中，雄烯二酮可優先通過雌激素受體α或雌激素受體β刺激INSL3合成，而真正的雄激素(如二氫睪酮)則無刺激INSL3合成的作用[18]。用阿比特龍處理卵泡發現，雄烯二酮本身可刺激分離的卵泡內膜細胞產生INSL3，主要由于阿比特龍可特異性下調17α-羥化酶的表達，進而導致INSL3表達下調[20]。

此外，骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)4、BMP5和BMP6等也可顯著抑制牛卵泡內膜細胞INSL3-RXFP2通路的表達，BMP可由卵母細胞和(或)顆粒細胞產生，通過絲氨酸/蘇氨酸激酶受體發揮作用[21]。研究發現，炎癥因子[如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)]和表皮生長因子在體外均可抑制牛卵泡內膜細胞中的INSL3-RXFP2通路；此外，胰島素和(或)胰島素樣生長因子1可促進牛卵泡內膜細胞中的INSL3合成[22]。目前的研究表明，INSL3與RXFP2作為自分泌/旁分泌系統共同發揮作用，在月經周期開始時協調和放大低水平LH、雄烯二酮和雌激素的作用，從而促進和協調月經周期的進行；上調卵泡BMP水平有助于抑制月經后期INSL3-RXFP2通路的表達，從而直接抑制INSL3的表達；高劑量人絨毛膜促性腺激素可影響獼猴卵泡液INSL3水平，表明INSL3可能在卵泡內起作用，直接調控卵母細胞的成熟[23]，但這些研究結果未來還需更多研究驗證。

2 INSL3在女性體內的表達

2.1循環系統中的INSL3 免疫測定法顯示，健康成年男性循環系統中的INSL3水平通常為0.5～2.0 ng/ml，而高靈敏度熒光免疫分析法顯示，女性循環系統中INSL3的檢出限為10 pg/ml；在女性的嬰兒期和幼兒期，INSL3無法檢測到，只有青春期才可檢測到INSL3，在健康的育齡期女性中，最高的INSL3表達水平僅約為200 pg/ml；在整個月經周期INSL3以階段性方式產生，并可代表竇卵泡生長的單個波，而女性月經周期中這種卵泡波具有可變性，某些女性卵泡期有2個波，另一些女性的卵泡期只有1個波[24]。由于女性卵泡波存在個體差異，整個月經周期中的INSL3平均水平并不具有代表意義。隨著更年期正常月經周期的停止，在循環系統中無法檢測到INSL3表達，因此絕經后女性的血清通常被作為INSL3免疫測定的陰性對照，表明卵巢可能是女性循環系統中INSL3的唯一來源[25]。

循環系統中的INSL3表達變化可反映健康年輕女性的卵泡內膜細胞功能。一項針對約1 000例不孕女性的橫斷面研究顯示，診斷為多囊卵巢綜合征的患者循環系統中的INSL3水平顯著升高，而通過竇卵泡計數和抗米勒管激素水平判定的卵巢儲備功能低下患者的INSL3水平顯著降低，且INSL3水平與竇卵泡計數呈顯著正相關[26]。有研究者通過測量不同大小牛竇卵泡內膜組織中的INSL3信使RNA水平發現，直至排卵前階段，其表達水平均穩定增加[27]。

2.2卵巢中的INSL3 原位RNA雜交實驗和免疫組織化學檢測法在奶牛、人類和狨猴的卵巢中均發現 INSL3表達，但在顆粒細胞、卵丘細胞或卵母細胞中卻未檢測到INSL3表達[28]。用兩種不同的INSL3抗體對牛卵巢進行免疫組織化學研究發現，在健康生長的竇卵泡中INSL3的表達水平最高，且INSL3缺失可能是卵泡閉鎖最早的標志物之一，甚至早于任何類固醇生成酶缺失[17，28]。此外，黃體中也存在INSL3信使RNA，在牛黃體期早期INSL3信使RNA表達較低，但隨著黃體的生長INSL3信使RNA的表達逐漸增加，而隨著黃體的溶解INSL3信使RNA的表達逐漸降低；在狨猴妊娠期間，其黃體中的INSL3表達較穩定，妊娠牛黃體中的INSL3信使RNA表達與狨猴妊娠期類似；在小鼠卵巢中，單個視野內的黃體INSL3染色不均勻，表明INSL3表達可能是一個動態模式，而這種動態表達是否有助于將INSL3分泌至循環系統目前尚不清楚[7]。

INSL3不僅可分泌至血液，還可積聚在竇卵泡液中。檢測獼猴和奶牛的卵泡液發現，與血液相比，卵泡液中的INSL3水平顯著升高，獼猴卵泡液中的INSL3濃度約為1 ng/ml，而牛卵泡液中的INSL3濃度高達400 ng/ml[18]。在獼猴體內注射人絨毛膜促性腺激素誘導排卵可導致竇卵泡中的INSL3水平降低，但在牛體內注射人絨毛膜促性腺激素并未發現INSL3水平與卵泡大小或類固醇水平的關系。

2.3妊娠期及胎兒體內的INSL3 有研究者通過比較受孕第17天的綿羊與非受孕綿羊的血清發現，INSL3可能成為妊娠早期的生物標志物；此外，懷有雌性胚胎的奶牛和豬妊娠中期血液中的INSL3水平與發情期的INSL3水平相似[29]。此外，在人子宮內膜上皮和胎盤中也檢測到低強度的INSL3免疫組織化學染色，特別是合體滋養層細胞[30]。在妊娠期間，男性胎兒也可產生INSL3，在妊娠早期至中期的過渡期間胎兒睪丸間質細胞可產生大量INSL3，且INSL3與胎兒睪丸下降的第一個經腹階段有關，其可激活胎兒韌帶上的RXFP2[31]。因此，羊水中的INSL3水平可作為睪丸發育良好的生物標志物[31-32]。在母牛體內，雄性胚胎內的INSL3可穿過胎膜和胎盤，因此在母牛外周血清中可檢測到INSL3表達，表明INSL3作為一種性別特異性激素，可影響胎盤和母牛的生理或病理狀態，且與類固醇不同，INSL3由男性胎兒特異性的產生，而女性胎兒在整個妊娠期間均未出現INSL3合成[31]。

3 小 結

在卵巢竇卵泡內，INSL3-RXFP2通路可通過刺激17α-羥化酶的表達促進雄烯二酮的產生。作為一種生物標志物，INSL3亦可在監測健康竇卵泡的生長方面發揮關鍵作用。INSL3是一種由卵巢產生的激素，在青春期至更年期循環系統中的INSL3水平為100～200 pg/ml，在此區間INSL3可很好地刺激遠端組織中的RXFP2。因此，INSL3或其同源受體激動劑均可作為更年期激素替代的新策略。此外，INSL3還可參與多囊卵巢綜合征的發生發展，但具體機制尚未明確。目前關于INSL3在女性生殖調節中的作用研究仍處于初級階段，未來還應深入研究INSL3在女性生殖調節中的作用，為以INSL3為靶點的女性生殖疾病藥物的研發提供幫助。