細胞熱轉移技術的研究進展

朱 茵，朱靜怡，趙起超，2，謝 恬，2，陳功星，2

（1.杭州師范大學醫學部，浙江 杭州 311121；2.浙產中藥材資源開發與應用浙江省工程實驗室，浙江 杭州 311121）

細胞熱轉移技術（cellular thermal shift assay，CETSA）是一種可直接檢測細胞或組織內藥物與靶標蛋白結合程度的研究方法，自2013 年研發以來，被廣泛應用于靶標蛋白的分析，其中大多數是細胞內的可溶性靶標蛋白；CETSA 最早通過PCR 和蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）技術顯示靶標結合情況，隨著該技術的不斷發展，CETSA 可在高密度微孔板中用均相法測定、顯示靶標結合情況，這一發展實現了CETSA 向高通量模式的轉變[1]。目前，CETSA 與雙向凝膠電泳（2-DE）、質譜分析法（MS）和熒光檢測法等技術的結合，推動了CETSA 走向一個新高峰，這有可能為蛋白質及其相關學科研究提供新的方向。本文將對該技術的原理、應用以及相關進展進行綜述，以期為推進CETSA 技術的應用和發展，生物大分子結合研究提供參考。

1 CETSA 技術的原理

蛋白質分子的空間構象決定了特定理化性質，細胞組織中的蛋白質可與相應分子結合。CETSA 的原理如下：蛋白質溶液在聚集溫度（aggregation temperature，Tagg）或熔解溫度（melting temperature，Tm）加熱，會以類似于蛋白質純化的方式先進行展開而后聚集，而當小分子物質與靶蛋白結合后，會使靶蛋白的熱穩定性增加，這種改變了Tagg 或Tm 從而改變熱誘導蛋白質的聚集，被稱為細胞熱轉移[1]。該技術的主要步驟是先用實驗組（藥物）和對照組（空載）分別處理活細胞或細胞裂解液，并在數分鐘內用熱（37 ℃～70 ℃）分別處理兩組，然后離心去除因熱變性而沉淀的蛋白，取上清可溶蛋白樣本，采用WB、2-DE、MS 等實驗方法測定并對比實驗組和對照組中的可溶性蛋白點，尋找出其中因熱穩定性發生變化而在兩組中顯示有所差異的蛋白，并按常規方法測定其氨基酸序列，再根據序列檢索蛋白質數據庫，進行生物信息學分析，最后根據分析結果驗證該蛋白的功能[2]。

2 CETSA 技術的應用

2.1 新藥研發 在CETSA 被發明之前，藥物開發面臨多重挑戰，臨床上大多數作用于細胞或組織的藥物是通過直接與一個或幾個靶蛋白結合而達到治療效果的，而藥物與靶蛋白的結合不能在細胞和組織中直接測量，研究者常需根據藥物在臨床試驗中的成敗才能證明該藥物能否與細胞或組織中的預期藥物靶點結合，這導致藥物研發成本高、周期長、危險性大。CETSA 作為一種非標記方法，可用于直接確認藥物是否與預期靶點結合，從而保障新藥的研發。此外CETSA 能在研究藥物作用的相關通路與機制的同時，確定藥物作用靶標的先后次序[3]。CETSA 的這些優勢不僅克服了以往藥物研發中的難關，還促進了藥物大規模的開發。目前，CETSA 已運用于抗微生物藥物、抗腫瘤等藥物的研發中，并取得一定成效，它很可能成為臨床前研究和臨床藥物開發的一個有效工具。

登革熱病毒和寨卡病毒為主要的黃病毒，該種病毒造成了世界性的健康和經濟問題。Rothan HA等[4]發現Hrd1 泛素連接酶介導的內質網相關蛋白降解通路可調控黃病毒在宿主內的復制，而化合物CDDO-Me 作為Hrd1 泛素連接酶的抑制劑，對登革熱病毒和寨卡病毒具有廣譜活性。應用CETSA 發現，CDDO-Me 與Hrd1 通路中的關鍵蛋白grp94 結合而發揮作用，如果對grp94 蛋白抑制劑進行深入的研究，就很可能會產生一類新的廣譜抗黃病毒藥物。與此相似，甲型流感病毒感染是一種威脅人類健康的世界性公共衛生疾病，隨著現有抗流感藥物耐藥性的不斷增強，迫切需要新的抗病毒藥物，特別是天然藥物。Lai YN 等[5]利用CETSA 證明天然藥物異歐前胡素對神經氨酸酶（NA）介導的子代病毒釋放過程有抑制作用，異歐前胡素可能將成為預防和治療甲型流感病毒的潛在藥物。

CETSA 在抗腫瘤藥物的研發中應用更為廣泛。Akt 是多種癌癥信號通路中的關鍵蛋白，也是肝細胞癌（HCC）的重要的調節因子，而Hongwei L 等[6]發現了一種名為HTBPI 的生物堿，并利用CETSA 證實HTBPI 可靶向Akt 并占據其結合域，使Akt 功能失活，從而抑制相關腫瘤分子通路，HTBPI 可能會成為靶向Akt 的HCC 潛在治療藥物。此外，研究人員[7]通過CETSA 等方法，證實化合物Aspulvinone O 是谷草酰胺轉移酶的有效抑制劑。它抑制了谷氨酰胺的代謝，使胰腺導管腺癌細胞抵抗氧化應激，進而抑制了癌細胞的增殖，這使得Aspulvinone O 有望成為治療胰腺導管腺癌的新型藥物。TACC3 基因表達在包括乳腺癌在內的多種癌癥中。Akbulut O 等[8]利用CETSA 等技術證實一種新的靶向藥物BO-264 與TACC3 相互作用，從而降低TACC3 表達，并實現抗癌作用，這為乳腺癌等化療藥物的研發提供了新方向。另外，不少研究者利用CETSA 尋找到了已有藥物的作用靶標和相關分子信號通路，這為藥物的創新打開了一扇門。例如藥物Daphnegiravone D（DGD）可誘導HCC 細胞凋亡和氧化應激，但其具體的靶蛋白仍不清楚。Shang XY 等[9]發現DGD 可改變許多蛋白的表達但以ART 蛋白的改變最為顯著，而CETSA 結果直接提示了DGD 可以直接靶向ART蛋白；STAT3 蛋白常常在癌癥細胞中上調，Lee YJ等[10]發現一種名為EXT 的蒼耳提取物可降低STA T3-Y705 的磷酸化表達，并利用CETSA 證明了EXT與STAT3 蛋白的結合，從而抑制STAT3 的激活，EXT 有望成為癌癥治療的有效藥物。

在其他藥物的研發中，一種名為M.accedens的植物可被用于外敷退熱，但其抗炎機制尚不清楚。Kim JY 等[11]利用CETSA 發現M.acedens 的甲醇提取物Ma-ME 可與NF-κB 信號通路中最上游的Syk蛋白結合，從而實現抗炎。抑制淀粉樣β 肽前體蛋白切割酶-1（BACE1）是治療阿爾茲海默癥的潛在途徑。Chambers M等[12]從ChemBridge DiverSet 化合物庫中選取了3 種待測化合物，并利用CETSA 篩選出了一種與BACE1 相結合的化合物C34，該分子將有望成為治療阿爾茲海默癥的潛在藥物。在肺部囊腫性纖維化治療中，單種藥物治療肺功能有很大的局限性，而Carlile GW 等[13]利用CETSA 證實伴侶分子MCG1516A 可能是治療囊腫性纖維化的第3 個重要藥理位點，推進了三聯藥物療法的發展以及囊性纖維化的治療進程。阻斷絲氨酸蛋白酶9（PCSK9）與低密度脂蛋白（LDL）受體進行蛋白與蛋白間的相互作用可有效降低LDL 膽固醇水平，而Petrilli WL 等[14]確定了一種與PCSK9 有著高親和力并能誘導其分解的化合物，從而阻斷了這種蛋白質之間的相互作用，有效降低了LDL 膽固醇水平。

2.2 藥物評估和優化 臨床上有些藥物治療效果良好，但其相關機制尚不能明確，而靶標結合狀態是評估藥物有效性和開發潛能的關鍵依據。CETSA 自開發以來，常用于細胞或組織水平的靶標結合情況的檢測，Ishii T 等[15]首次報道了CETSA 應用于動物和臨床研究，證實了CETSA 可以定量評估小鼠脾臟以及大腦內藥物的靶標參與。Perrin J 等[16]則通過Blood-CETSA 實驗檢測了組織和全血中藥物的靶標結合情況，進一步拓展了該技術的檢測范圍，同時也為藥物的臨床評估和優化奠定了基礎。

CETSA 可以檢測藥物與細胞內靶蛋白的結合狀況從而有效評估藥物作用效果，同時這也為優化藥物在細胞內的靶標結合提供了新思路[17]。抗病毒藥物在復雜的生理環境中使用時，可能會產生脫靶效應，Tomas F 等[18]利用MS-CETSA 評估了FDA 批準的一組抗病毒化合物在宿主細胞中的靶點，以此更好的了解藥物脫靶與療效之間的關系，該方法可以用于快速篩選和利用已存在的抗病毒藥物來應對新出現的病毒，有望成為研發抗2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV）藥物的有效方法。此外，STAT3 蛋白往往在癌癥細胞中上調，除了在利用CETSA 開發STAT3 抑制劑的同時，還可評估已知的STAT3 抑制劑在生物環境中與STAT 蛋白的結合能力，從而實現CETSA 對相關藥物從研發到評估和優化的全程利用[19]。Tan BX 等[20]還通過CETSA 驗證一種新型治療藥物——裝訂肽（stapled peptide）與Mdm2 基因和Mdm4 基因的結合，發現仍需要進一步提高裝訂肽進入細胞和結合靶標的效率，而CETSA 的存在則為優化該藥物提供了有效的工具。CETSA 也為優化藥物的耐藥性提供了思路，Langeback A 等[21]利用CETSA 評估患者在臨床治療中對紫杉烷類藥物的敏感性和耐藥性，以便對不同患者的用藥進行劑量分層，實現了紫杉醇類藥物治療的優化。

2.3 基因表達 基因表達是分子生物學的重要內容，而蛋白質的研究開展較困難，CETSA 可應用于對基因表達的研究。Dai L 等[22]利用CETSA 發現許多蛋白質復合體在細胞周期特定階段的表達有所不同，反映出這些蛋白在核膜解體、DNA 復制、轉錄、翻譯等過程中的作用意義，這為研究完整細胞中蛋白質的相互作用提供了新方法。

3 CETSA 技術的新發展

技術的特征之一就是不斷的改進以滿足科學發展的需要。CETSA 的原理是基于靶蛋白在結合藥物分子后通常變得穩定，也可利用其他方法顯現出來。在CETSA 創立之初，研究者通常用WB 和PCR 檢測，但隨著CETSA 的不斷發展，CETSA 逐漸與2-DE、MS、熒光檢測等技術相結合，實現了CETSA 向高通量的轉變，同時極大拓寬了CETSA 的應用范圍，受到更多研究者認可及應用，并不斷地創新。

3.1 基于雙向凝膠電泳的CETSA 技術 Nagasawa I等[23]將CETSA 和雙向凝膠電泳（2-DE）結合起來形成基于雙向凝膠電泳的CETSA 技術（2DECETSA），用它對結合了新化合物后熱穩定性發生變化的蛋白組學進行分析，并成功利用這種方法發現一種名為NPD10084 的化合物，作用于PKM2 蛋白并阻斷PKM2 與β-catenin 或STAT3 蛋白的作用，從而抑制下游通路來實現對直結腸癌細胞的抑制，2D-CETSA 可進行全蛋白組范圍內靶標蛋白篩選，尤其適用于未知靶標的藥物，這為探究未知的靶蛋白和新藥的研發提供了強大工具。擴展到蛋白組范圍內的CETSA 使得實驗數據更加精確化和科學化，減小了傳統CETSA 的限制性，使得細胞熱轉移技術有了一個大的飛躍。

3.2 基于質譜分析技術的細胞熱轉移技術 在過去10 年中，質譜分析技術（MS）取得了巨大進展，現在MS 可以快速對人類蛋白質組中天然和修飾的蛋白質或者肽進行分子量測定[24]。基于質譜分析技術的細胞熱轉移技術（MS-CETSA）是利用MS 對CETSA中的可溶性蛋白進行分子量的測定，再通過蛋白數據庫分析該蛋白，MS-CETSA 現已被用于識別各種藥物的未知靶點[25]，這也為研究者提供了一個可同時觀察由化合物介導的數千種蛋白質穩定性改變的平臺[26]。現如今該技術較為成熟，應用也較廣泛，MS-CETSA 為人們提供了一個研究蛋白功能變化的詳細而全面的新平臺[25]。例如Sun W 等[27]提出MSCETSA 可以直接在蛋白質組水平上監測ROS 和蛋白結構的氧化還原變化，了解不同蛋白質在細胞活性氧反應中的特定作用，并且還發現了新的活性氧敏感性候選蛋白。大多數蛋白質與代謝物之間的相互作用弱于蛋白質與藥物之間的相互作用，而研究者又缺乏對傳統CETSA 的特異性和假陽性的分析，此為CETSA 的一大缺陷。而Lim YT 等[28]則通過利用MS-CETSA 來快速顯示蛋白質與代謝物在裂解物或細胞中的相互作用，彌補了這一缺陷。總之，MS-CETSA 相對于傳統的CETSA 的優勢是可以鑒定藥物直接作用的靶標蛋白及其對下游通路的影響，并且可以檢測反應微弱的蛋白質與代謝物之間的作用，是CETSA 的一個極大優勢。

3.3 基于熒光檢測法的CETSA 技術 Martinez NJ等[29]介紹了一種基于分裂納米熒光素酶的CETSA技術（SplitLuc CETSA），該技術是一種以高通量（384 和1536 孔板）形式的檢測方法，無需檢測試劑與蛋白的結合，對于各種靶標有廣泛適用性，為不易獲得表型和需要與蛋白結合才能測定的方法定提供了一個快速的檢測和篩選平臺。Asawa RR 等[30]運用SplitLuc CETSA 檢測了394 種已知的組蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）抑制劑與HDAC1 的結合效果，并從中發現了兩種靶向其他HDAC 的抑制劑。此外，Park H 等[31]開發了一種基于熱穩定性改變能夠引起凝膠內熒光差異原理的檢測技術（TS-FITGE），這是一種無需標記并可用于蛋白質組范圍內目標識別的方法，可通過定量分析凝膠圖像來找到因結合藥物后熱穩定性改變的靶蛋白，同時還可繪制融化曲線來證實陽性變化。

3.4 高通量CETSA 技術的開發 分析技術高通量是研究的一大優勢，研究表明，高通量細胞熱轉移技術（HT-CETSA）可以在96、384 和1536 孔微孔板內進行，并可聯合使用β-半乳糖苷酶、熒光素酶報告基因和AlphaLISA 均相酶聯免疫分析等技術進行檢測。HT-CETSA 方法還可通過劑量反應實驗來優選化合物[32]。如今此方法已運用于不少研究，雄激素受體（AR）是前列腺癌的關鍵驅動因子，然而在研究中缺乏相關細胞學方法來區分直接結合AR，或間接作用于AR 共調節因子的抑制劑，而Shaw J 等[33]利用HT-CETSA 解決了這個問題。

3.5 其他 CETSA 可用MS、WB 或AlphaScreen 等技術對可溶性蛋白進行定量和檢測，但這些方法可能會耗費大量時間和細胞；為了解決CETSA 對蛋白質量需求高的問題，Herledan A 等[34]開發了名為細胞熱轉移-聲學反相蛋白質陣列的技術——CETSAaRPPA，該方法將CETSA 的優點與納米聲學傳輸系統和反相蛋白質陣列技術的優點相結合，可以在小樣本的條件下同時分析多種藥物靶點，是一種快速、經濟的方法。此外，Kawatkar A 等[35]還對CETSA 技術進行了改良，表明在CETSA 的加熱步驟后用去污劑對細胞進行提取，可以使CETSA 應用于多種復雜膜蛋白的測定和分析。

4 總結與展望

CETSA 作為一種可以直接檢測靶標參與狀況的技術，越來越多的應用于藥物靶標研究中，其在新藥研發、藥物評估與優化，以及疾病治療等領域具有重要的理論指導意義和實用價值，近幾年來不少學者 也 提 出 了 2D -CETSA、MS -CETSA、SplitLuc CETSA、HT-CETSA 等技術改進，并將CETSA 研究領域進一步拓展到了基因表達等方面。

技術的進步必然促進科學的發展，此后可以借助CETSA 技術的各種新方法研究細胞內針對性藥物作用和耐藥性機制，從而確定現有藥物是否適合個體患者。這對于開展個性化治療的實現具有潛在應用價值，并且完全有可能預先為臨床醫生提供確定的治療方案，這對確定像腫瘤一樣疑難疾病是否已經產生某種抗藥性以及何種類型的治療可更適合特定病人的研究有極大幫助。此外，長期受制于分子作用機制未明的中草藥和進展緩慢的蛋白質分子生物學的研究，可借助于CETSA 技術得到更好的發展。