自噬在結直腸癌中的研究進展

戴星辰，王芳，高玉婧，吳曉婷

(1.寧夏醫科大學總醫院消化內科，銀川 750004； 2.寧夏醫科大學 a.臨床醫學院，b.基礎醫學院生物化學與分子生物學系，銀川 750004)

結直腸癌約占全球每年確診的癌癥和癌癥相關死亡人數的10%，且女性發病率和病死率較男性低約25%[1]。據2018年中國國家癌癥中心報告顯示，雖然我國結直腸癌的發病率低于世界平均水平，但由于人口眾多，我國結直腸癌新發病例和相關死亡病例仍居世界前列[2]。隨著人民生活水平的提高、生活方式西化趨勢，兒童結直腸癌患者也顯著增加，給患者家庭及社會均造成沉重的經濟負擔[3]。除泛素蛋白酶體系統外，自噬是真核細胞中另一個主要的蛋白質降解途徑。與蛋白酶體局限于降解單個泛素化蛋白的功能不同，自噬是機體大規模降解部分細胞質(包括完整的細胞器、蛋白質、脂質和糖原等)的主要方式。然而，自噬并非一種簡單的分解代謝過程，還包括生物合成及能量產生的過程。自噬包括大自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬。雖然自噬的類型存在差異，但均有一個共同特征，即最終目的均是將細胞內“貨車蛋白”(cargo)運送至溶酶體腔內[4-5]。大自噬在細胞內普遍存在，因此通常所稱的自噬即為大自噬。現就自噬在結直腸癌中的研究進展予以綜述。

1 自噬的形成過程

自噬是一種在應激條件下產生的細胞內降解過程，常見的應激包括細胞器損傷、異常蛋白質的存在以及營養缺乏等。在應激條件下，細胞質中損傷的細胞器、異常折疊的蛋白質、病毒和細菌等周圍可形成吞噬泡或隔離膜，將其隔離為一個雙層膜結構的自噬小體；自噬小體形成后，將其包裹的內容物協同運送至溶酶體附近，小體外膜與溶酶體融合形成自噬溶酶體，其內容物再被溶酶體的相關水解酶降解；自噬溶酶體內的降解產物可在細胞內循環利用，以滿足細胞的代謝需求[6]。自噬的這種“自我消化后循環利用”過程通過細胞骨架微管網絡系統實現，其中微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)-Ⅰ可與磷脂酰乙醇胺偶聯，并加工形成LC3-Ⅱ，因此研究人員可通過蛋白免疫印跡法檢測LC3-Ⅱ和(或)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，判斷自噬流水平，評價自噬活躍程度[7]。

2 自噬調節在結直腸癌發生中的作用

腫瘤的發生是多種應激條件下產生的漸進式突變及變異，其中涉及基因、表觀遺傳學以及周邊微環境的變化，且逐漸不受體內機制的調節和控制，最終形成腫瘤細胞。而自噬在腫瘤發生中起重要作用，這種作用不僅體現在對腫瘤發生的抑制作用，還包括對腫瘤發生的促進作用[8]。

2.1自噬對結直腸癌的抑制作用 自噬可通過抑制炎癥反應、維持基因組穩定性、促進細胞衰老等機制抑制腫瘤的發生，并在腫瘤生長過程中起重要作用[9]。炎性腸病包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，其長期存在可增加患者罹患結直腸癌的風險[10]。因此，抑制炎癥反應有助于結直腸癌的早期預防與控制。K?kten等[11]發現，抑制髓樣細胞觸發受體1可恢復正常細胞受損的自噬活性，減輕小鼠結腸炎的嚴重程度。與腸道炎癥相關基因及受體的發現，為結腸炎與結直腸癌的相關研究提供了理論依據。

自噬發生于細胞質中，但其在維持基因組穩定中也發揮關鍵作用。自噬可通過線粒體自噬和抗氧化防御等過程調節活性氧類(reactive oxygen specie，ROS)的產生或通過選擇性降解核成分和修復DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break，DSB)來維持基因組的穩定性[12]。Liu等[13]研究發現，brahma相關基因1作為一個與自噬相關的關鍵調控因子，可通過自噬依賴的氧化應激作用減輕結腸炎癥、減少腫瘤的發生，主要表現為brahma相關基因1缺陷的腸上皮細胞的自噬存在缺陷，導致ROS水平升高，影響腸道屏障完整性。DJ-1是一種帕金森病蛋白7基因編碼的高度保守的同源二聚體蛋白，最初被克隆為與H-Ras協同轉化小鼠胚胎NIH/3T3細胞的癌基因[14]。Zhou等[15]發現，DJ-1缺失可導致線粒體功能障礙和ROS積聚，進而抑制結直腸癌細胞生長。亮氨酸拉鏈EF-hand結構域跨膜蛋白1是一種線粒體內膜蛋白，在包括結直腸癌在內的多種腫瘤中高表達[16]。Che等[17]研究表明，沉默亮氨酸拉鏈EF-hand結構域跨膜蛋白1可通過觸發ROS介導的AMP活化的蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路，誘導結直腸癌細胞自噬，從而阻斷結直腸癌的進展。以上研究表明，抗氧化相關防御機制可通過調節ROS影響自噬，從而抑制結直腸癌的發生和進展。

Wang等[18]發現一種新的核自噬底物，即沉默信息調節因子1，沉默信息調節因子1缺失可促進機體衰老過程中免疫系統抵抗力降低，因此選擇性針對衰老過程中核自噬底物的降解可能成為一種抑制衰老和衰老相關疾病的新途徑。此外，與選擇性降解核成分有關的EB病毒BamHIF片段也可選擇性誘導并改善自噬過程中核膜的囊泡運輸作用，在核裂解發生時，其可將核內成分運輸至胞質并及時清除，這一發現為聚集性相關疾病的治療提供了依據[19]。

共濟失調毛細血管擴張突變基因是DNA損傷修復反應的重要組成部分，由細胞核中的DSB激活[20]。Seiwert等[21]研究表明，DSB以共濟失調毛細血管擴張突變基因和p53依賴的方式觸發有利于生存的自噬，這種自噬可被蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)2信號抑制，因此Akt2可抑制結直腸癌細胞DSB引發的促生存自噬。泛素特異蛋白酶14是電離輻射反應中環指蛋白168表達及其相關泛素信號的關鍵負調控因子[22]。Sharma等[23]發現，泛素特異蛋白酶14的DSB修復功能依賴于人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tension homologue deleted on chromsome ten gene，PTEN)缺陷的晚期腫瘤組織中Akt的激活，泛素特異蛋白酶14抑制或敲低均可恢復PTEN與自噬缺陷細胞中非同源性末端連接核心復合物的組裝以及DSB修復信號。Wang等[24]發現，選擇性自噬可調節DSB修復過程中的染色質泛素化，自噬受體和底物p62/SQSTM1(sequestosome 1)可抑制DSB誘導的組蛋白和染色質泛素化，在吸引關鍵修復因子到斷裂相應位點過程中起關鍵作用。

癌基因誘導的細胞衰老(oncogene-induced cellular senescence，OIS)是一個高度動態的復雜過程，涉及多種不同的效應機制。OIS在致癌信號異常激活時被觸發，可抑制細胞的增殖，相關癌基因誘導的衰老也可促進腫瘤的發生和發展[25]。此外，原癌基因(如Ras、Akt和細胞周期蛋白E)的激活以及抑癌基因(如PTEN1)的失活也可誘導OIS[26-27]。但自噬與OIS發生過程的相關性目前仍不清楚。研究證實，完整的自噬對衰老相關分泌表型有積極影響，自噬的激活可促進細胞衰老[28]。有研究表明，mTOR作為自噬啟動的內在抑制劑，對衰老相關分泌表型具有積極的控制作用[29]。Su等[30]發現，阻斷經典的蛋白(包括多囊腎病基因1、肌營養不良蛋白關聯糖蛋白、磷脂酶D1和磷脂酰肌醇-4-激酶2β等)分泌途徑，可減少白細胞介素(interleukin，IL)-6和IL-8的分泌，并導致衰老相關分泌表型誘導的衰老細胞中的IL-6、IL-8積聚，干擾蛋白激酶D1介導的經典蛋白分泌通路則可影響Ras相應OIS的建立，同時可誘導衰老的成纖維細胞和腫瘤細胞凋亡。

2.2自噬對結直腸癌的促進作用 提高細胞的自噬水平可有效抑制早期腫瘤的發生和生長，但在多數情況下，腫瘤細胞表現出較正常細胞更強的自噬依賴性，因此一定基礎水平的自噬對于正常的組織動態平衡非常重要，可促進腫瘤細胞的存活和生長[31]。而自噬在促進腫瘤細胞存活和增殖方面主要表現為可增強腫瘤細胞對內外界的應激能力以及提高自身代謝水平兩方面的效應。

腫瘤細胞面臨的應激壓力主要包括葡萄糖、氨基酸等營養物質的缺乏以及缺氧、饑餓和內質網應激等[32]。營養物質缺乏一方面可抑制腫瘤細胞生長，另一方面也可通過p27調控mTOR活性而激活自噬[33]。mTOR是一種可感知細胞代謝水平的感受器，氨基酸(如谷氨酰胺)及生長因子等均可增強mTOR復合物1活性[34-35]。腫瘤細胞氨基酸水平降低，可解除其對Ras/Raf1/胞外信號調節激酶的抑制，從而激活自噬[36-37]。腫瘤細胞葡萄糖水平降低，可導致AMP/ATP比值升高，從而激活AMP活化的蛋白激酶感受器，進而激活自噬[38]。Ge等[39]發現，在人類結直腸癌細胞(SW480細胞和HCT116細胞)中敲除Livin基因可消除饑餓誘導的自噬。表明在饑餓或營養缺乏等情況下，結直腸癌細胞與自噬密切相關。營養物質缺乏等可通過一系列途徑激活自噬，導致細胞內破損的細胞器和大分子營養物質被降解，從而被細胞循環利用，以滿足腫瘤細胞的生長需求。

此外，低氧及ROS水平升高也可激活自噬，并通過自噬分解、合成，為腫瘤細胞的生長提供必要的生物成分。低氧可通過兩種途徑激活自噬：①上調缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)表達，HIF-1α可使B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia，Bcl-2)/腺病毒E1B 19 kDa結合蛋白3和Bcl-2/腺病毒E1B 19 kDa結合蛋白3樣蛋白的表達增加，從而激活自噬[40-41]。②低氧可導致細胞微環境pH值降低，酸化微環境可上調磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt/mTOR信號通路的表達，從而激活自噬[42-43]。饑餓可導致c-Jun氨基端激酶激活，從而使Bcl-2磷酸化，導致Bcl-2-Beclin-1復合物發生解離，最終誘導自噬發生，該過程亦有ROS參與[44-45]。Myc等原癌基因過表達可增加內質網應激壓力，產生過量或錯誤折疊的蛋白[46]。這些過量或錯誤折疊的蛋白不利于腫瘤細胞的生長，而自噬可有效清除這些蛋白，促進腫瘤細胞存活。Che等[47]發現，結直腸癌細胞中缺氧介導的自噬受miR-20a/自噬相關蛋白5/FIP200(分子量為200 000的黏著斑激酶家族相互作用蛋白)信號通路的調控，而在結直腸癌的發生過程中，miR-20a介導的自噬缺陷可能在缺氧誘導的自噬中起重要作用。Deng等[48]研究表明，錨蛋白重復結構域蛋白37對低氧環境下自噬激活和結直腸癌細胞的適應性均非常重要。以上研究為缺氧誘導結直腸癌自噬的機制提供了理論支持，值得研究者進一步探索。

腫瘤細胞大多通過糖酵解途徑獲得能量，即使在有氧或營養充足的條件下也是如此。線粒體自噬和分子伴侶介導的自噬均可幫助腫瘤細胞由有氧氧化轉向糖酵解途徑獲取能量[49-50]。K-Ras作為Ras的一種異構體，在肺癌、結直腸癌、胰腺癌等腫瘤細胞中均有表達[51]。K-Ras持續表達是原發性和轉移性結直腸癌細胞生存所必需，且K-Ras可通過激活轉化生長因子-β信號通路促進腫瘤的侵襲和轉移[52]。K-Ras激活可導致細胞代謝水平升高，腫瘤細胞為了應對這種高代謝需求，需要更多營養物質和能量的合成。自噬缺失可導致三羧酸循環相關中間產物的水平顯著降低，從而使K-Ras突變細胞的增殖能力及活力均顯著減弱[53]。因此，自噬的存在可滿足K-Ras突變細胞代謝和營養的需求，有助于結直腸癌細胞的存活。V-Raf鼠肉瘤病毒致癌基因同源物B1基因突變常見于黑素瘤、甲狀腺癌和結直腸腺癌等，V-Raf鼠肉瘤病毒致癌基因同源物B1基因過表達可導致黑色素瘤細胞中的線粒體合成速度顯著降低，從而促進細胞有氧氧化向糖酵解途徑轉變[53-54]。鈣調磷酸酶調節因子1-1L在氧化應激時表達上調，可導致AMP/ATP比值升高，從而通過AMP活化的蛋白激酶途徑抑制mTOR通路，增加線粒體自噬，同時還可促進細胞能量代謝向糖酵解途徑轉化[55]。

此外，自噬還可降低機體的免疫反應，導致細胞因子合成、分泌減少，促進腫瘤細胞的存活。Yamamoto等[56]發現，自噬可通過降解主要組織相容性復合體Ⅰ促進胰腺癌細胞免疫逃逸，從而使腫瘤細胞存活。Maisonneuve等[57]發現，NOD樣受體可促進自噬激活、調節髓系細胞的免疫抑制活性，幫助結直腸癌細胞成功逃避免疫系統的攻擊。目前關于自噬通過抑制免疫促進結直腸癌發生與發展的研究較少，仍需未來進一步研究。

總之，自噬在腫瘤的發生中具有雙重作用。在結直腸癌發生的早期，自噬常通過抑制炎癥反應、維持基因組穩定性、促進細胞衰老等機制保護正常細胞的穩定和生長，并抑制正常細胞向腫瘤細胞轉變；在結直腸癌發生的晚期，腫瘤已經初步形成，初始腫瘤細胞需要克服周邊微環境營養不足等影響而不斷生長，最后轉化為成熟腫瘤細胞。因此，研究者可借助自噬對腫瘤細胞的雙重作用、針對結直腸癌不同的生長階段，通過相關藥物或基因水平的調控靶向作用于結直腸癌，達到抑制腫瘤生長的目的。

3 自噬在結直腸癌新輔助聯合化療中的作用

化療是中晚期和轉移性結直腸癌患者的主要治療方法，而5-氟尿嘧啶等氟尿嘧啶類是姑息性和新輔助聯合化療的重要組成部分。但人群耐藥性的產生，給結直腸癌患者的治療帶來較大困難[58]。結直腸癌患者常伴隨細胞周期和糖代謝異常、氧化應激、線粒體活性增強以及上皮-間充質轉化等，這些因素均可促進5-氟尿嘧啶耐藥性的產生，導致腫瘤細胞在凋亡與自噬中的作用中趨于平衡，并順利存活[59]。除FOLFOX方案(5-氟尿嘧啶+亞葉酸鈣+奧沙利鉑)[60]外，研究人員還嘗試利用5-氟尿嘧啶聯合其他非傳統化療藥物(或物質)方案克服5-氟尿嘧啶耐藥性帶來的治療局限。非傳統化療藥物(或物質)主要包括傳統中藥及其衍生物、降糖藥、抗生素以及腫瘤治療場等。

6-姜烯酚是一種從生姜中提取的中藥成分，具有一定的抗腫瘤作用[61]。Woz＇niak等[62]發現，在人結腸癌細胞(SW480細胞)中，與應用單一化療藥物治療相比，6-姜烯酚聯合傳統化療藥物的療效顯著升高，主要表現為Beclin-1、自噬相關蛋白7等自噬相關蛋白及Bcl-2、Bcl-2相關X蛋白、胱天蛋白酶3等凋亡相關蛋白表達均顯著上調，表明姜烯酚可能參與自噬激活及凋亡相關通路，進而發揮抗腫瘤效應，但具體作用機制目前尚未明確。

二甲雙胍是一種傳統降糖藥物，近年來其非降糖作用越來越受到研究者關注。人前梯度蛋白2是近年發現的一種與結直腸癌發生有關的因子，可促進腫瘤的發展和轉移，且其高表達幾乎完全局限于惡性腫瘤[63]。Martisova等[64]發現，二甲雙胍聯合5-氟尿嘧啶和奧沙利鉑可誘導ROS產生，同時導致結直腸癌保護性自噬作用減弱，但在人前梯度蛋白2敲除的SW480細胞中這種作用顯著增強，這為結直腸癌的治療提供了新思路。

克拉霉素是一種大環內酯類抗生素，臨床主要用于革蘭陽性菌引起的相關疾病的治療。hERG1(human ether-a-go-go-related gene 1)基因是一種電壓門控鉀離子通道，其編碼的hERG1鉀通道能夠在包括結直腸癌在內的多種腫瘤細胞中選擇性表達，并與腫瘤的侵襲力和化療敏感性密切相關[65]。Petroni等[66]發現，克拉霉素可增強體內、外試驗中5-氟尿嘧啶對HCT116細胞的毒性，且伴隨胱天蛋白酶3水平和胞外信號調節激酶1/2磷酸化水平降低，其主要通過削弱hERG1與磷脂酰肌醇-3-激酶之間的相互作用影響磷脂酰肌醇-3-激酶/Akt通路，從而調節結腸癌細胞的自噬水平，增強其化療敏感性。

腫瘤治療場是一種低強度、中頻、交變電場，可通過非侵入性傳感器陣列在腫瘤解剖區域周圍局部傳遞[67]。Lee等[68]發現，腫瘤治療場聯合5-氟尿嘧啶治療可導致體外實驗和小鼠體內實驗中自噬小體顯著增加、LC3表達顯著上調，與單一化療藥物治療相比，腫瘤治療場聯合化療藥物治療可加速結直腸癌細胞凋亡。因此，5-氟尿嘧啶與其他藥物(或物質)聯合的新輔助化療方案，可在一定程度上消除自噬為腫瘤細胞提供的保護及營養作用。

4 小 結

自噬是正常細胞重要的生理功能之一，其廣泛存在于包括結直腸癌在內的多腫瘤細胞，并通過一系列生理作用影響結直腸癌細胞的生長。自噬在結直腸癌的發生發展中具有雙重作用，但其具體作用機制目前仍未明確。結直腸癌的發生涉及基因、表觀遺傳學以及周邊微環境的變化等，而自噬在其中起重要作用。因此，未來深入研究自噬在結直腸癌中的具體靶點及作用機制，可以為結直腸癌患者的治療提供更多選擇。