環狀RNA的生物學功能及其在不同分子分型乳腺癌中的研究進展

伊茹，蔡鳳林，符德元

(1.大連醫科大學，遼寧 大連 116044； 2.江蘇省蘇北人民醫院甲狀腺乳腺外科，江蘇 揚州 225001)

環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類具有共價閉環結構，沒有5′端7-甲基鳥苷三磷酸“帽子”和3′端多聚體“尾巴”的非編碼RNA。circRNA包括外顯子circRNA、內含子circRNA、外顯子-內含子circRNA和基因間circRNA四類[1]。circRNA由前體信使RNA(messenger RNA，mRNA)環化形成，多數存在于細胞質，也有一些內含子形成的circRNA存在于細胞核[2]。經典RNA檢測方法通常只能識別RNA分子的多聚體“尾巴”結構，故circRNA在既往研究中常被忽略[3]。circRNA最早于1976年在植物病毒中被發現，其具有特殊的形態學特征，對核酸外切酶的耐受性高，較親本線性RNA更穩定[4]?，F已鑒定出真核生物中20 000多種circRNA，它可以存在于外泌體，并隨外泌體在體液(如血液、尿液、唾液)和母乳中循環[5]。由于其進化保守性、結構穩定性以及組織表達特異性，circRNA可能在腫瘤中作為特殊的分子標志物發揮作用。

乳腺癌是女性中最常見的癌癥，也是全球癌癥死亡的主要原因，其分子特征及臨床表型具有高度異型性[6]。circRNA不僅參與調控乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，還可能是乳腺癌早期診斷、個體化預后評價的新型分子標志物。現對circRNA作用于不同分子分型乳腺癌的機制予以綜述，以期為尋求更有價值的乳腺癌應對策略和更精確的靶向療法提供新思路。

1 circRNA的生物學功能

近年來，隨著大量circRNA的發現，其與腫瘤和其他疾病相關的生物學功能逐漸顯現。circRNA可通過調節特定基因表達，參與細胞生長、信號轉導、受體激活等過程，從而影響人類疾病的發生。circRNA的生物學功能包括：通過circRNA-微RNA(microRNA，miRNA)-mRNA軸發揮海綿作用，翻譯蛋白質；調控親本基因表達；與RNA結合蛋白相互作用等。

1.1海綿作用 circRNA作為競爭性內源RNA發揮其特定功能。circRNA分子富含miRNA結合位點，可通過miRNA應答元件吸附miRNA，并負調控miRNA活性，因此被視為“miRNA海綿”[7]。ciRS-7(也稱為cDR1as)是第一個被定義為“miRNA海綿”的circRNA，ciRS-7包含70個以上miR-7保守結合位點，可在致癌基因和抑癌基因復雜網絡的調節中起作用，并可顯著抑制miR-7活性，促進miR-7靶向致癌因子上調，從而調節腫瘤細胞的增殖[8-9]。多種circRNA在乳腺癌進程(細胞增殖、侵襲、遷移和耐藥性)中被激活，其中包括一些上調的circRNA，如hsa_circ_100876通過抑制miR-361-3p的表達促進乳腺癌細胞的增殖和轉移[10]。circTADA2A-E6是由轉錄適配器2A經反向剪接形成的circRNA，它可作為miR-203a-3p和miR-302c-3p的海綿，促進乳腺癌細胞的轉移[11]。circCER作為海綿抑制miR-136的活性，導致乳腺癌細胞增殖和遷移增加[12]。對阿霉素耐藥乳腺癌組織的研究證實，hsa_circ_0006528在阿霉素耐藥的人乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231細胞中上調[13]。下調的circRNA，如hsa_circ_000911通過使miR-449a海綿化正向調控跨膜受體蛋白Notch1表達，抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲[14]。hsa_circ_0072309通過調控miR-492增加G0/G1期階段的細胞數量，抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖，抑制乳腺癌進展[15]。circRNA還可通過miRNA海綿調節腫瘤的代謝，如circHIPK3通過調控miR-124抑制糖酵解中關鍵酶的表達[16]。circGFRA1通過調控miR-34a促進三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)組織中的脂肪吞噬，完成脂質利用[17]。circRNA的海綿作用可對應一個或多個miRNA，現已證實hsa_circ_0001358可與5個miRNA(miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-376a-3p、miR-376b-3p和miR-429)結合[18]。circHIPK3共有18個潛在miRNA結合位點(每個miRNA有1～3個結合位點)，至少可以結合9種miRNA[19]。但僅少數circRNA顯示出miRNA海綿特性[20]。

1.2翻譯功能 有些circRNA具有翻譯功能。circRNA的翻譯無法通過依賴5′端7-甲基鳥苷三磷酸“帽子”的調控元件啟動，因此需要內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)或其他元件激活不依賴“帽子”結構的途徑。有研究證實，一些circRNA具有通過IRES依賴性途徑和N6-甲基腺苷依賴性途徑編碼蛋白質的能力[21]。circZNF609序列存在開放閱讀框和非翻譯區，且circZNF609的非翻譯區能夠作為IRES驅動IRES依賴性翻譯，證實circRNA具有編碼能力。circZNF609可作為miRNA海綿促進乳腺癌進展，也可在肌生成過程中編碼蛋白[22]。SHPRH-146aa是circSHPRH產生的一種新蛋白質，可抑制神經膠質瘤的發生[23]。由包含7的F-Box和WD重復域(F-Box and WD repeat domain containing 7，FBXW7)衍生的circRNA——circFBXW7是一種抑癌circRNA，circFBXW7可以編碼含有185個氨基酸的肽(FBXW7-185aa)，而FBXW7-185aa可通過誘導癌基因c-Myc的降解，抑制TNBC細胞的增殖和遷移[24]。上述circRNA編碼的肽通過干擾腫瘤的新陳代謝或轉移發揮抗腫瘤作用[25]。circRNA雖然打破了傳統非編碼RNA的特性，但與線性對應物相比，環形模板的翻譯活性較線性模板低，且具有一定的組織、時序特異性，但不同物種間進化保守。

1.3參與親本基因調控 circRNA參與了mRNA的前期剪接，并可作為親本mRNA轉錄的活性啟動子[3]。circRNA通過上調RNA聚合酶Ⅱ的活性刺激其親本基因轉錄，從而引發其作為RNA聚合酶Ⅱ正向調節劑的潛在作用[26]。一些外顯子-內含子circRNA(如circEIF3J和circPAIP2)可能通過與核小RNA之間的RNA-RNA相互作用，進一步與RNA聚合酶Ⅱ轉錄復合物在啟動子處相互作用，這種非編碼RNA之間特異性的RNA-RNA相互作用，可能是非編碼RNA功能機制的核心主題之一。外顯子-內含子circRNA可能通過調控轉錄來增加親本mRNA和自身表達水平[27]。此外，circCNOT2等帶有起始密碼子的circRNA可能通過啟用親本線性mRNA另一個起始密碼子的翻譯來影響親本基因的表達[2]。

1.4與RNA結合蛋白的相互作用 RNA結合蛋白通過調節基因表達，幾乎在所有細胞過程中均發揮關鍵作用，如細胞的增殖、分化、運動、衰老、凋亡以及細胞對應激、有絲分裂原和免疫觸發的反應等。circRNA可與不同RNA結合蛋白相互作用形成特定的RNA-蛋白質復合體，從而影響相關蛋白質的作用方式或影響自身生物發生過程[28]。由多聚腺嘌呤結合蛋白核1基因產生的環狀多聚腺嘌呤結合蛋白核1與人抗原R結合可能會抑制其介導的翻譯過程[29]。在非癌細胞中高表達的circFOXO3通過形成circFOXO3-p21-cDK2三元復合物阻斷細胞周期進程[30]。由細胞周期蛋白B1產生的circCCNB1可以與細胞周期蛋白B1和細胞周期蛋白依賴性激酶1相互作用，改變乳腺癌中抑癌基因p53基因突變的影響[31]。此外，circRNA還可作為調節蛋白質-蛋白質相互作用的動態支架分子，作為非編碼RNA修飾表觀遺傳等作用[32]。circRNA通過其特定的生物學功能在腫瘤相關進程中起重要作用，circRNA的生物學功能及其在腫瘤發生發展過程中的作用機制仍需要進一步探索，以為臨床工作提供新的診療方向。

2 circRNA與不同分子分型乳腺癌

根據免疫組織化學染色顯示的乳腺腫瘤關鍵蛋白的表達將乳腺癌分為雌激素受體(estrogen receptor，ER)陽性乳腺癌、孕激素受體(progesterone receptor,PGR)陽性乳腺癌、人表皮生長因子受體(human epithelial growth factor receptor，HER)2陽性乳腺癌以及缺乏以上3種蛋白質標記的TNBC。研究發現，circRNA不僅與不同分子分型乳腺癌的發生和發展進程有關，且與乳腺癌化療過程中的不良反應及耐藥性密切相關[33]。

2.1circRNA與TNBC 與其他乳腺癌亞型相比，TNBC在年輕女性中更常見，其組織學分級較高，且通常預后不良。circRNA與TNBC細胞增殖和腫瘤生長、侵襲和轉移有關，還可調節TNBC細胞對治療藥物的耐藥性等[34]。通過RNA測序技術，circRNA在TNBC組織和相鄰正常組織之間差異表達，且circRNA表達水平與TNBC患者臨床分期和預后密切相關。circSEPT9由SEPT9(Septin 9)前體mRNA經反向剪接環化形成，可通過調控miR-637減輕其對白血病抑制因子的抑制，激活涉及TNBC進程的白血病抑制因子/信號轉導及轉錄激活因子3信號通路，導致TNBC的發生和發展[35]。含有蛋白1的Arf GAP結構域和FG重復序列產生的circAGFG1可通過調控miR-195-5p減少對G1/S期特異性細胞周期蛋白E1的抑制，從而促進TNBC細胞增殖和轉移并抑制細胞凋亡[36]。hsa_circ_007294可通過調控miR-148a-3p和miR-152-3p誘導上皮-間充質轉化，進而促進TNBC的侵襲和轉移[37]。上皮基質相互作用蛋白1產生的circEPSTI1通過調控miR-4753和miR-6809，上調乳腺癌L11A基因的表達，并影響TNBC的增殖和凋亡。高水平circEPSTI1與TNBC患者生存期縮短有關[38]。驅動蛋白超家族成員4A(kinesin family member 4A，KIF4A)產生的circKIF4A通過調控miR-375上調癌基因KIF4A的表達，從而調節TNBC細胞的增殖和遷移[39]。circIFI30通過上調miR-520b-3p靶基因CD44的表達促進TNBC細胞增殖、侵襲[40]。泛素結合酶E2 D2環化產生的circUBE2D2通過調控miR-512-3p調節癌基因CDCA3的表達，與TNBC不良預后有關[41]。circWAC通過調控miR-142減少miR-142對WW結構域E3泛素蛋白連接酶1基因的抑制作用，調節TNBC細胞中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路的傳導活性，并影響其對紫杉醇的敏感性[33]。由核受體亞家族C組成員2產生的circNR3C2通過miR-513a-3p促進TNBC中羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶降解蛋白1介導的腫瘤抑制作用[42]。羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶降解蛋白1通過誘導泛素化抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲。

2.2circRNA與HER-2陽性乳腺癌 HER-2陽性乳腺癌占所有乳腺癌的20%～30%[43]，具有浸潤性強、易復發轉移、無病生存期短等特點。對HER-2陽性乳腺癌細胞和正常乳腺上皮細胞中circRNA差異表達譜的研究發現，差異表達的circRNA在磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路中顯著富集，并與蛋白質的絲氨酸/蘇氨酸激酶調控活性顯著相關[44]。HER-2陽性乳腺癌細胞中，circRNA表達譜與正常乳腺上皮細胞表達譜存在顯著差異，差異表達的circRNA可作為HER-2陽性乳腺癌的潛在診斷或治療靶標。有研究表明，與其他亞型乳腺癌患者相比，HER-2陽性乳腺癌患者差異表達的circRNA數目更多[45]。TNBC和HER-2陽性乳腺癌樣本中circ-HER2(一種HER-2基因的環狀形式)的表達高于鄰近正常組織，且circHER2的狀態與總生存時間呈負相關[45-46]。此外，circHER2還編碼蛋白質HER-103。所有HER-2陽性乳腺癌細胞系及部分TNBC細胞系均表達HER-103，而Luminal型乳腺癌細胞系不表達HER-103[46]。HER-103在HER-2陽性乳腺癌中的作用還有待進一步研究，但其表達可能提示circRNA不僅通過miRNA在乳腺癌中發揮作用，其翻譯功能編碼的蛋白質也可能是調控乳腺癌發生發展過程中的關鍵環節。

2.3circRNA與Luminal型乳腺癌 約70%的乳腺癌為激素受體陽性[43]。已知大量circRNA可被雌激素誘導，對PGR基因產生的雌激素誘導程度最高的6個 circRNA(circPGR1～6)的研究發現，circPGR作為競爭性內源RNA可調控miR-301a-5p的作用，促進ER陽性乳腺癌細胞的生長和腫瘤發生[47]。circPGR在ER陽性乳腺癌細胞系中高表達，而靶向circPGR的反義寡核苷酸可有效抑制乳腺癌細胞的生長，ER陽性乳腺癌中hsa_circ_0087378下調，且hsa_circ_0087378/miR-1260b/分泌型卷曲相關蛋白1軸也被認為是調控ER陽性乳腺癌進程的關鍵途徑[47-48]。hsa_circ_0025202通過調控miR-182-5p抑制乳腺癌細胞進展，并提高乳腺癌細胞對他莫昔芬內分泌治療的敏感性[49]。通過在線微陣列分析(Gene Expression Omnibus)研究發現，與非腫瘤組織相比，Luminal亞型乳腺癌組織中存在多個差異表達的circRNA，hsa_circRNA_100689和hsa_circRNA_005239可能參與了Luminal亞型乳腺癌的發生、發展與分子調控進程[50]，這可能有助于新型Luminal亞型乳腺癌治療靶點的研究。

circRNA在乳腺癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和耐藥中發揮了巨大的調控功能。目前，circRNA與乳腺癌的相關性研究主要集中于其作為競爭性內源RNA的海綿作用，circRNA通過翻譯功能和結合RNA結合蛋白調控乳腺癌的潛力有待進一步挖掘。與傳統腫瘤生物標志物相比，circRNA在腫瘤診斷及其預后判斷中的靈敏度和特異度更高，在乳腺癌等腫瘤的發生和發展中發揮重要作用。circRNA的環狀結構穩定，使其在血液或尿液中的半衰期延長，為circRNA作為生物標志物提供了條件[51]。此外，結合乳腺癌中特異表達的蛋白與差異表達的circRNA有望成為新的治療靶點。

3 小 結

circRNA的生物發生不是隨機的剪接錯誤，是RNA家族中繼miRNA后發現的又一種重要腫瘤調節因子。circRNA存在于所有生命形式(包括真核生物、細菌等)中，證明了circRNA的重要性。乳腺癌發病率和復發率均較高，因此急需尋找有效的診斷與治療方法，不同circRNA以及傳統標志物的同時檢測可能具有更高的診斷效率。circRNA在癌癥治療中的潛力亦受到重視。靶向circRNA的治療可能成為腫瘤治療的一種新模式。目前已根據真核生物circRNA的來源、功能、體內分布等建立了統一的歸類方法，有助于進一步探索其作為診斷性生物標志物以及疾病治療靶標的潛力。