液體活檢在前列腺癌診治中的研究進展

董振坤，張璐，陳輝

(哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院泌尿外科，哈爾濱 150081)

液體活檢是指利用體液作為樣本來源檢測獲取相關疾病信息的技術，是繼高通量測序技術后應用于腫瘤基因診斷的新突破。作為組織學檢測的補充手段，液體活檢具有成本低、不良反應小、可重復取樣、有效應對腫瘤異質性等優點[1]。同時，液體活檢以體液中脫落的腫瘤細胞和腫瘤細胞的基因片段作為檢測標志物，實現了與組織活檢的一致性[2]。脫落的腫瘤細胞或腫瘤細胞的基因片段主要包括可以從體液中純化并分析以確定腫瘤特異性突變、拷貝數變異、基因重排和其他腫瘤導致的遺傳異常的循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)、細胞游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)和基于微RNA(microRNA，miRNA)的外泌體等[3]。液體活檢具有廣泛的應用前景，其不僅在疾病診斷、療效判斷及疾病監測等方面發揮重要作用，同時為臨床醫師和患者提供了一種無創、實時、低樣本量、高效且分析全面的腫瘤基因診療技術。

目前，治療前列腺癌面臨的挑戰是需要進行連續的組織活檢來捕捉前列腺癌不斷演變的基因異質性，由于進展的時間周期通常以年為單位進行計算，在臨床實踐中很難實現。前列腺癌組織活檢的另一挑戰是在臨床轉移時，擴散的主要部位為骨骼，這增加了活檢取樣的難度，且在技術上很難獲得用于基因檢測的基于腫瘤組織的樣本。而采用CTC和基于游離核酸的液體活檢技術為克服傳統腫瘤活檢技術不足提供了一種潛在的解決方案。現就各種基于液體活檢的生物標志物檢測在前列腺癌中的研究進展予以綜述，以為前列腺癌患者的臨床診療提供新思路。

1 基于CTC的液體活檢

1.1液體活檢的重要來源 CTC是自發或因診療操作脫離實體瘤原發灶或轉移灶進入外周血循環的腫瘤細胞。其來源于原發腫瘤組織，是腫瘤細胞轉移的重要方式，也是復發和激發腫瘤致死機制的重要因素。隨著實體腫瘤的生長，周圍微環境發生了特定變化，有一部分腫瘤細胞會獲得異常的活動能力。CTC不僅包含腫瘤的DNA信息，同時還包含基因組、蛋白質組等信息，是研究腫瘤組織信息的重要來源。為了評估治療選擇壓力下不斷演變的前列腺癌的潛在異質性，CTC可作為一種無創的方式用來研究前列腺癌的分子特征[4]。CTC的富集方法可以分為生物化學特性富集法和物理特性富集法。其中，生物化學特性富集法主要通過細胞表面特異性表達的蛋白標志物分離靶細胞。物理特性富集法主要根據CTC的大小、密度、力學和介電性能等物理特性將CTC篩選出來。在前列腺癌的發生發展過程中，不僅CTC的數目在動態變化，CTC所攜帶的分子標志物也在變化。因此，通過檢測CTC表面標志物，能夠反映腫瘤發生發展的動態變化，是研究腫瘤發生發展機制的有效策略，并能很好地指導臨床治療。目前，轉移性去勢抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC)中的CTC計數已被美國食品藥品管理局批準作為一種預后標志物，并已在前瞻性試驗中得到證實[5-6]。

1.2CTC對前列腺癌治療反應的預測作用 CTC檢測可以預測前列腺癌患者的治療反應，指導前列腺癌的治療。通過對前列腺癌患者內分泌治療反應的預測，特別是對進展到去勢抵抗性前列腺癌階段患者治療反應的預測，可以有針對性地選擇化療或者新型內分泌治療。Riaz等[3]使用CTC AdnaTest前列腺癌平臺從7.5 ml血液中捕獲CTC，進行CTC分離和富集后，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測細胞中雄激素受體全長和雄激素受體剪切變異體7(androgen receptor splice variant 7，AR-V7)的表達。結果顯示，可通過基于CTC的AR-V7的檢測與血清前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)相結合評估前列腺癌患者對內分泌治療的反應。另一項使用相同CTC平臺對202例應用阿比特龍或恩扎魯胺治療的mCRPC患者進行的大規模前瞻性研究中，采用基于CTC的AR-V7信使RNA檢測評估了CTC檢測和AR-V7檢測的預后價值，結果顯示，CTC陰性患者效果最好，CTC陽性/AR-V7陰性患者效果稍差，CTC陽性/AR-V7陽性患者效果較差[7]。另外，CTC檢測可以對治療反應進行預測，在該研究中有26%的mCRPC患者沒有檢測到CTC，有75.5%的CTC陰性患者觀察到對阿比特龍或恩扎魯胺治療的反應[7]。上述研究表明，CTC中表達的AR-V7是一個潛在的預測生物標志物，且與阿比特龍和恩扎魯胺耐藥相關。

1.3CTC對前列腺癌預后的評估作用 CTC檢測具有無創和可重復的特點，通過檢測CTC特異性表達的蛋白標志物水平，可以評估前列腺癌患者的預后。Armstrong等[8]對118例接受雄激素受體抑制劑治療的mCRPC患者進行前瞻性臨床試驗，觀察CTC中的基線AR-V7水平是否對患者接受抗雄激素治療的預后有預測意義。結果表明，AR-V7陽性患者的平均無進展生存期為3.1個月，而陰性患者為6.1個月；總生存期的差異則更顯著，AR-V7陽性患者的總生存期為8個月，而陰性患者總生存期超過2年。因此，AR-V7陽性的患者不應繼續接受抗雄激素治療，而應改為化療或其他治療。AR-V7作為治療反應生物標志物的作用不僅限于雄激素受體抑制劑，其中AR-V7陰性轉化為陽性常發生于接受雄激素受體抑制劑治療的患者，而AR-V7陽性轉化為陰性只發生在接受紫杉醇化療的患者中[9]。因此，通過CTC檢測可以對前列腺癌治療進行動態的監測，有效評估前列腺癌患者的預后。

目前，基于CTC分子預測的應用主要受限于CTC檢測能力，而檢測CTC的能力又取決于前列腺癌所處的階段。由于全血CTC的檢出率在早期階段和無轉移狀態非常低，在疾病早期，基于CTC的檢測方法的應用價值有限，需要進一步完善檢測平臺以提高檢測敏感性，并在臨床實踐中使用最合適的檢測參數和分子標記。

2 基于cfDNA和ctDNA的液體活檢

2.1cfDNA和ctDNA的來源 cfDNA是血漿等體液中的游離DNA，是不包含在完整細胞結構內的DNA，其以裸露核酸的形式存在且高度片段化，可由正常細胞或異常細胞(如腫瘤細胞)等產生，可應用于腫瘤學、器官移植排異監測及產前診斷等領域。而ctDNA是指腫瘤細胞釋放的、攜帶腫瘤基因信息的DNA片段(包括突變、缺少、插入、重排、拷貝數異常、甲基化等)，是cfDNA的一部分，在腫瘤診療中研究最為廣泛。ctDNA可以通過高通量測序獲得全基因組分析的數據，進而通過基因檢測指導靶向藥物臨床應用。ctDNA的基本特征為水平低，根據已有研究，ctDNA在cfDNA中占0.01%～1%，且受瘤種和疾病期別等因素的影響[10]。在晚期前列腺癌患者血漿中ctDNA的水平較高，研究也相對較多，而ctDNA在早期前列腺癌中的研究則受限于ctDNA水平。近年來，ctNDA的相關研究取得了突破性進展，隨著多種檢測技術的升級，ctDNA檢測的敏感性和特異性均得到大幅度提高。

2.2cfDNA和ctDNA在前列腺癌中的應用 ctDNA在前列腺癌的精準治療中具有重要作用，可以替代組織標本進行基因檢測，特別是在無法獲得組織標本的患者中，ctDNA提供了新的檢測途徑。同時，ctDNA解決了前列腺癌組織活檢腫瘤異質性的問題，可以準確反映前列腺癌的基因改變。此外，ctDNA在轉移性激素敏感性前列腺癌和mCRPC患者中均與不良預后相關，可作為預后判斷的標志物。另外，ctDNA與治療反應相關，可以對系統治療反應進行評估。研究發現，與基線水平相比，患者接受雄激素受體抑制劑(如醋酸阿比特龍和恩扎魯胺) 治療后ctDNA水平明顯降低[11]。而一項試驗發現，對標準治療無效且DNA修復基因缺陷的前列腺癌患者使用PARP抑制劑奧拉帕利治療4周后，患者血漿cfDNA總下降率超過50%且與無進展生存期相關，表明cfDNA具有預后判斷意義[12]。cfDNA作為晚期前列腺癌的生物標志物，不僅可以通過血液標本檢測，還可以通過尿液進行檢測。在一項針對轉移性激素敏感性前列腺癌患者使用雄激素剝奪治療和mCRPC患者中使用多西他賽化療的研究中，學者對尿樣cfDNA進行了全基因組測序，以確定腫瘤相關的拷貝數變化，結果顯示拷貝數分析能夠檢測到常見的基因組異常，并在50%的CRPC患者中檢測到雄激素受體擴增[13-15]。

盡管cfDNA是理想的前列腺癌早篩生物標志物，但其面臨的技術挑戰也不容忽視。首先，需要獲得健康人的cfDNA基線，cfDNA有獨特的斷裂方式，釋放到血漿中的cfDNA并不是均勻覆蓋基因組，因此健康人基線對于靈敏度檢測非常關鍵。其次，為獲得合理的測序深度和染色體結構變異算法，需要不斷的技術優化。最后，能否檢測到前列腺癌特異的染色體結構變異并以此作為腫瘤早篩的分子標記，尚需要積累更多樣本并借助大數據來積累更多的證據。

3 基于外泌體的液體活檢

3.1外泌體的功能 外泌體是多泡小體與質膜融合時釋放到細胞外環境中的小囊泡，含有從親代細胞選擇性富集的RNA。外泌體攜帶了參與細胞內信號轉導的蛋白、miRNA、長鏈非編碼RNA、環狀RNA、信使RNA以及其降解片段，參與細胞重要活動的調控。外泌體是細胞間信息交流的重要組成部分，腫瘤細胞經常以外泌體為生物媒介從而促進實體瘤的生長。同時，外泌體在腫瘤轉移、免疫調控機制、疾病發生發展、疾病耐藥等方面具有重要研究價值。血漿外泌體RNA可作為前列腺癌患者的診斷、預后甚至治療的生物標志物。

3.2外泌體RNA檢測在前列腺癌中的應用 等離子體來源的外泌體RNA是前列腺癌AR-V7檢測的重要來源，通過外泌體RNA檢測可以監測前列腺癌患者的疾病進展及評估治療反應。2016年，研究首次證實可以從癌細胞小泡中提取的RNA進行AR-V7檢測，在一項對26例前列腺癌患者接受阿比特龍和恩扎魯胺治療的研究中，61%的患者AR-V7呈陰性，且AR-V7陰性患者的中位無進展生存期、總生存期明顯長于AR-V7陽性患者，表明在前列腺癌患者中進行AR-V7 RNA檢測具有一定預后意義[16]。此外，一項針對mCRPC患者的研究進行了血漿外泌體miRNA的RNA測序，使用實時定量聚合酶鏈反應進一步評估miRNA的預后價值，結果發現375個已知和57個新的miRNA，同時發現miR-1290、miR-1246和miR-375與總生存期相關；另外，該研究還發現miR-375可通過靶向SEC23A和Yes相關蛋白1基因誘導前列腺癌多西他賽耐藥，所以miR-375也可以作為多西他賽耐藥的預測生物標志物[17-18]。以上研究證實，外泌體RNA是前列腺癌的生物標志物，是前列腺癌相關RNA檢測的重要來源，同時外泌體RNA也為前列腺癌相關RNA檢測提供新途徑。

外泌體作為細胞間通訊的重要介質，參與前列腺癌微環境中多種細胞之間的生物信號傳遞及前列腺癌發生和發展過程。雖然外泌體應用的前景廣闊，但目前仍處于研究階段，其提取、純化的技術難度較高，還缺乏更加經濟有效的分離技術。此外，并非所有前列腺癌特征均能夠通過RNA突變表現出來，故外泌體作為目前研究的熱門領域，其在前列腺癌中的形成與分泌機制還需深入研究。

4 基于尿液RNA的液體活檢

4.1尿液前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3，PCA3)檢測 前列腺癌可以釋放具有腫瘤特異性的游離RNA到尿液中，通過檢測尿液相關標志物可以對前列腺癌進行早期診斷。PCA3是一種具有高度特異性的前列腺癌特異性抗原，它是編碼在染色體9q21～22上的非編碼RNA[19]，在前列腺正常組織中不表達，在前列腺增生組織中低表達，但在前列腺癌組織中高表達。研究表明，尿液PCA3與血清PSA水平升高相關，對PSA水平升高的患者在穿刺活檢前進行前列腺按摩后的尿液檢測顯示，PCA3預測惡性腫瘤的靈敏度為69%，特異度為79%[20]。因此，尿液PCA3是前列腺癌篩查的潛在生物標志物，但仍需進行大樣本臨床試驗證實尿液PCA3的檢測可降低前列腺癌的病死率。

4.2尿液PCA3檢測的診斷價值 尿液PCA3聯合PSA檢測可以提高前列腺癌的檢出率，特別是對需要二次穿刺活檢的患者具有指導意義。在一項包括1 140例患者的PCA3試驗中，所有血清PSA水平中度升高前列腺活檢為陰性的患者PCA3與再活檢陽性率顯著相關，并與Gleason評分相關[21]。同時，包括12 265例接受PCA3檢測患者的薈萃分析顯示，盡管沒有區分首次活檢和重復活檢，但檢測前列腺癌的靈敏度和特異度分別為65%和73%[22]。另外，雌激素受體基因(estrogen receptor gene，ERG)的基因融合是前列腺癌中常見的分子改變，對前列腺癌患者尿液中跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)-ERG融合檢測的研究發現，其診斷的特異度高達93%，陽性預測值為94%，但聯合尿液PCA3和TMPRSS2-ERG RNA融合檢測高Gleason評分腫瘤的靈敏度僅為37%[23-24]。而另一項研究中，在保留95%靈敏度的閾值下聯合兩種檢測方法也僅能將前列腺癌的診斷特異度從18%提高至39%[25]，因此聯合檢測的價值需進一步的前瞻性研究證實。PCA3評分的增加預示著前列腺癌風險的增加，并可預測活檢的結果，PCA3聯合血清PSA和其他危險因素可顯著提高診斷準確率。另外，尿液PCA3和TMPRSS2-ERG檢測雖不是晚期前列腺癌分期的可靠依據，但可用于評估晚期前列腺癌對抗雄激素治療的反應。

4.3尿液miRNA檢測的價值 miRNA是在前列腺癌細胞、尿沉淀物和外泌體中均可檢測到的以游離形式存在的長度為18～25個核苷酸的短小非編碼RNA，可通過分解特定靶信使RNA或抑制其翻譯來阻止蛋白質表達而發揮作用[26]。尿液miRNA檢測對前列腺癌具有診斷價值，研究表明，前列腺癌患者尿沉淀物中的miR-107和miR-574-3p水平明顯高于對照者[27-28]。此外，前列腺癌患者尿液中miR-183和miR-205檢測前列腺癌的靈敏度和特異度分別為80%、72%和19%、26%，而兩種miRNA聯合檢測前列腺癌的靈敏度和特異度分別為60%和69%[29]。另有研究表明，直腸指檢后尿液標本中可檢測到miR-183和miR-205，而兩種miRNA聯合檢測前列腺癌的靈敏度和特異度分別為90%和3%[30]。miR-183和miR-205雖然在癌組織中高度異常表達，但對早期前列腺癌診斷價值有限。在不同分期的前列腺癌中，不同風險特征的miRNA表達譜存在差異，但基于前列腺癌不同分期miRNA的研究，由于缺乏臨床相關證據，目前仍處于研究階段。

5 小 結

精準醫學根據分子特征識別可以接受特定治療的患者亞群，徹底改變了人們對前列腺癌的理解和治療。基于CTC、cfDNA、ctDNA和外泌體檢測的液體活檢技術可以預測前列腺癌的進展和預后，并更有效地確定合適的精準治療方案，在前列腺癌診斷和治療中發揮重要作用，是前列腺癌最具前景的無創檢測技術。但液體活檢廣泛應用于臨床也面臨諸多挑戰，不僅需要檢測技術敏感性和特異性的提高、臨床研究的積累，還需要建立相應的檢測標準和建設規范的監管體系。隨著液體活檢標志物的精準識別和檢測技術的發展，未來液體活檢技術將為臨床醫師和患者提供最前沿且穩定的腫瘤診斷方式。