基于UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS技術(shù)的苗族藥刺梨葉化學(xué)成分分析△

徐浩然，喬溪瑩，2a，張童畫(huà)，于庚原，畢玥琳，馮欣，韋坤益，孫毅坤*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；

2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬護(hù)國(guó)寺中醫(yī)醫(yī)院，北京 100035

刺梨葉又稱(chēng)繅絲花葉，是薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt.及單瓣繅絲花R.roxburghiiTratt.f.normalisRehd.et Wils.的干燥葉，主產(chǎn)地為貴州，為貴州苗族等少數(shù)民族用藥。刺梨葉味甘、酸澀，歸脾、腎、胃經(jīng)，具有消食化積的功效，主治食積、疥痛、破傷風(fēng)等癥，是小兒消食開(kāi)胃顆粒和消痞和胃膠囊的組成藥味之一[1-2]。現(xiàn)代研究表明，刺梨葉中含有黃酮、氨基酸、有機(jī)酸、多酚、三萜、植物甾醇和維生素C 等多種化學(xué)物質(zhì)[3-4]。但是，有關(guān)刺梨葉化學(xué)成分全面分析鑒定的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜法（UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）對(duì)刺梨葉中的化學(xué)成分進(jìn)行定性鑒定研究，為刺梨葉后續(xù)藥理作用研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CPA225D 型電子天平（德國(guó)Sartorius 公司）；HH-S4A 型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超純水儀（北京五洲東方科技有限公司）；U3000型超高效液相色譜、QExactive 型質(zhì)譜儀[美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，配有電噴霧離子源（ESI）及Xcalibur 3.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)]。

1.2 試藥

刺梨葉（批號(hào)：20190302，貴州永樂(lè)藥業(yè)有限公司）經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院孫毅坤教授鑒定為薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt.及單瓣繅絲花R.roxburghiiTratt.f.normalisRehd.et Wils.的干燥葉，陰干，粉碎，備用；水為超純水；甲醇、乙腈和甲酸為質(zhì)譜級(jí)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取刺梨葉粉末3.00 g 置于100 mL 具塞錐形瓶中，按照料液比1∶10 精密加入75%甲醇30.0 mL，搖勻，水浴加熱回流2 h，取出靜置放冷，上清液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液做進(jìn)一步分析。

2.2 色譜條件

色譜柱為Waters UPLC C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，5%B；2～17 min，5%～98%B；17～20 min，98%B；20～23 min，98%～5%B；23～25 min，5%B）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.3 質(zhì)譜條件

離子源為ESI；在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描，掃描方式為全掃描/數(shù)據(jù)依賴(lài)二級(jí)掃描（Full scan/ddMS2），掃描范圍為m/z100～1200；毛細(xì)管溫度為350 ℃；負(fù)離子模式下噴霧電壓為3800 V，正離子模式下噴霧電壓為3200 V；鞘氣流速為35 arb；輔助氣流速為15 arb；MS2采用低、中、高3 種碰撞能，正離子模式下碰撞能分別為30、40、50 eV，負(fù)離子模式下碰撞能分別為30、50、70 eV；一級(jí)質(zhì)譜分辨率為Full Scan 70 000 FWHM（Full Width at Half Maximum），二級(jí)質(zhì)譜分辨率為MS/MS 17 500 FWHM。

2.4 化學(xué)成分檢測(cè)與分析

取2.1 項(xiàng)下供試品溶液5 μL，按照2.2 項(xiàng)下色譜條件及2.3 項(xiàng)下質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，采用檢測(cè)得到刺梨葉化學(xué)成分的m/z和保留時(shí)間（tR）等質(zhì)譜信息。使用Xcalibur 3.0軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理，通過(guò)高分辨率質(zhì)譜信息推導(dǎo)其可能的分子式，質(zhì)譜偏差（δ）≤5×10-6。分析正、負(fù)離子模式下一級(jí)質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰及二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)及化合物裂解規(guī)律共鑒定化學(xué)成分。

3 結(jié)果與分析

3.1 刺梨葉化學(xué)成分分析

根據(jù)正、負(fù)離子模式下一級(jí)質(zhì)譜的準(zhǔn)分子離子峰及二級(jí)質(zhì)譜特征碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)及化合物裂解規(guī)律共鑒定出刺梨葉中57 個(gè)化學(xué)成分。ESI+和ESI-模式下刺梨葉的基峰離子流（BPI）色譜圖見(jiàn)圖1～2，鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 刺梨葉中化學(xué)成分鑒定

續(xù)表1

續(xù)表1

圖1 ESI+模式下刺梨葉的BPI圖

圖2 ESI-模式下刺梨葉的BPI圖

3.2 裂解規(guī)律推導(dǎo)

3.2.1 黃酮類(lèi)成分分析 從刺梨葉中共鑒定出21個(gè)黃酮類(lèi)化合物。黃酮類(lèi)化合物泛指2 個(gè)苯環(huán)通過(guò)中央3 個(gè)碳原子互相連接而成的具有C6-C3-C6基本骨架的化合物在其A 環(huán)和B 環(huán)上常連接甲基或者甲氧基等官能團(tuán)，并且常與糖結(jié)合成苷。黃酮類(lèi)化合物的主要裂解方式以糖苷鍵斷裂，狄爾斯-阿爾德（RDA）反應(yīng)裂解，CO2、CO等中性離子丟失為主。

化合物11的tR為1.16 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z289.070 7 [M-H]-，推斷其分子式為C15H14O6；二級(jí)質(zhì)譜圖中母離子失去1 分子H2O 得到m/z271.061 6離子，失去1分子CO2得到m/z245.082 1離子，在C 環(huán)發(fā)生RDA 裂解生成m/z137.023 5 的離子碎片，結(jié)合負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子及特征碎片離子信息，比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)可確定該化合物為黃酮類(lèi)化合物兒茶素[2,8-9]，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3，特征裂解規(guī)律見(jiàn)圖4。

圖3 兒茶素的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖4 兒茶素的質(zhì)譜裂解規(guī)律

化合物25的tR為5.34 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z577.135 7[M-H]-，即原花青素B2的C 環(huán)經(jīng)RDA 裂解失去C8H8O3后再失去1 分子H2O 得到二級(jí)碎片m/z407.077 9[M-H-C8H8O3-H2O]-，以及化學(xué)鍵斷裂后得到m/z289.072 3 [M-H-C15H12O6]-、m/z205.050 3[M-H-C15H12O6-2（C2H2O）]-等特征碎片。參照負(fù)離子模式下的質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰及特征碎片，再比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)[16]可確定該化合物是黃酮類(lèi)化合物原花青素B2。其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5，裂解規(guī)律見(jiàn)圖6。

圖5 原花青素B2的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖6 原花青素B2的質(zhì)譜裂解途徑

化合物35的tR為6.98 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z593.152 0 [M-H]-，同時(shí)可以觀察m/z285.040 6[M-H-C11H20O6]-、m/z255.030 0[M-HC11H20O6-CH2O]-、m/z227.035 0[M-H-C11H20O6-CH2O-CO]-、m/z163.039 4[M-H-C21H18O10]-、m/z145.028 6[M-H-C21H20O11]-等特征碎片。參照負(fù)離子模式下的質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰及特征碎片，再根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[8]可確定該化合物是黃酮類(lèi)化合物忍冬苷。其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7，裂解規(guī)律見(jiàn)圖8。

圖7 忍冬苷的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖8 忍冬苷的質(zhì)譜裂解途徑

3.2.2 有機(jī)酸類(lèi)成分解析 以化合物24為例，其tR為4.63 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z353.088 1[MH]-，同時(shí)二級(jí)裂解圖譜可見(jiàn)m/z191.055 7[M-HC9H6O3]-、m/z179.034 4[M-H-C7H10O5]-的碎片離子，提示酰氧鍵產(chǎn)生了斷裂，產(chǎn)生了奎寧酸和咖啡酸的碎片，2個(gè)碎片隨后發(fā)生進(jìn)一步裂解失去H2O或CO2產(chǎn)生了m/z173.044 9[M-H-C9H6O3-H2O]-、m/z155.034 0[M-H-C9H6O3-2H2O]-、m/z137.023 7[M-H-C9H6O3-3H2O]-、m/z179.034 4[M-HC7H10O5]-、m/z161.023 8[M-H-C7H10O5-H2O]-、m/z135.044 3 [M-H-C9H6O3-CO2]-等特征碎片。參照負(fù)離子模式下質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰及特征碎片，再比對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)可確定該化合物為有機(jī)酸類(lèi)化合物綠原酸[8,15]，其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖9，裂解規(guī)律見(jiàn)圖10。

圖9 綠原酸的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖10 綠原酸的裂解途徑

3.2.3 三萜類(lèi)成分分析 在刺梨葉中共鑒定出3 個(gè)三萜類(lèi)成分，包括刺梨苷、薔薇酸（野鴉椿酸）、委陵菜酸。以化合物47 為例，其tR為9.56 min，可觀察到準(zhǔn)分子離子峰m/z649.396 4[M-H]-，同時(shí)可以觀察到明顯的m/z487.343 9 [M-H-C6H9O5]-、m/z469.332 3 [M -H -C6H9O5-H2O]-、m/z457.337 8[M-H-C6H9O5-CH2O]-、m/z441.341 1[M-H-C6H9O5-H2O-CO]-、m/z425.342 8 [MH-C6H9O5-H2O-CO2]-、m/z407.333 3 [M-HC6H9O5-H2O-CO2-H2O]-等的特征碎片。參照負(fù)離子模式下的質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰和特征碎片，推測(cè)該化合物是三萜類(lèi)化合物刺梨苷。其二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖11，裂解規(guī)律見(jiàn)圖12。

圖11 刺梨苷的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖12 刺梨苷的質(zhì)譜裂解途徑

4 討論

本研究建立的UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地鑒定刺梨葉中的化學(xué)成分，共鑒定化合物57 個(gè)，包括黃酮類(lèi)21 個(gè)、氨基酸類(lèi)12個(gè)、有機(jī)酸類(lèi)10 個(gè)、多酚類(lèi)5 個(gè)、三萜類(lèi)3 個(gè)、植物甾醇類(lèi)2 個(gè)、蒽醌類(lèi)1 個(gè)、四環(huán)二萜類(lèi)1 個(gè)、香豆素類(lèi)1個(gè)及其他類(lèi)化合物1個(gè)。基于三萜類(lèi)成分在所鑒定化合物中響應(yīng)較好且具有一定藥理作用，同時(shí)參照中藥質(zhì)量標(biāo)志物選取原則[30]，對(duì)刺梨葉中代表性三萜類(lèi)化合物刺梨苷進(jìn)行了裂解規(guī)律推導(dǎo)，為刺梨葉藥效機(jī)制、體內(nèi)代謝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

本研究前期考察了提取溶劑（水、50%甲醇、75% 甲醇、甲醇）、提取時(shí)間（1.0、1.5、2.0、3.0 h）、稀釋倍數(shù)（5、10、15 倍），對(duì)提取方法進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，采用75%甲醇水浴回流2 h提取、稀釋10 倍進(jìn)樣，得到的色譜峰信息較多，各分析物響應(yīng)也較好。

通過(guò)對(duì)比分析刺梨葉同科植物成分分析的研究可知，在薔薇科大部分藥用植物中均含有黃酮、三萜及有機(jī)酸類(lèi)成分。例如，刺玫果為薔薇科薔薇屬植物山刺玫R.davuricaPall.的干燥成熟果實(shí)，主要含有蘆丁、金絲桃苷、橙皮苷、槲皮素等黃酮類(lèi)物質(zhì)，其中黃酮類(lèi)化合物含量相對(duì)較高[31]。徐艷春等[32]發(fā)現(xiàn)同為薔薇科薔薇屬的植物金櫻子中含有鞣質(zhì)、皂苷、三萜等多種化合物，其中三萜類(lèi)成分的含量很高，并且具有一定的藥理作用，故建議將其作為質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。薔薇科植物山楂中含有多種有機(jī)酸類(lèi)成分，謝穎等[33]建立了基于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）的高效液相色譜法（HPLC），對(duì)山楂中的熊果酸和齊墩果酸進(jìn)行了含量測(cè)定。有研究發(fā)現(xiàn)薔薇科植物的果實(shí)常具有“酸”的藥性，如刺梨果、烏梅、金櫻子和覆盆子等，而有機(jī)酸類(lèi)成分常被認(rèn)為是“酸”性中藥的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[34]。

刺梨葉中的主要活性化學(xué)成分為黃酮、多酚、有機(jī)酸和三萜等類(lèi)化合物。黃酮類(lèi)化合物藥理作用主要與降血糖、調(diào)血脂、抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤有關(guān)[35]。兒茶素及其類(lèi)似的具有黃酮母核的化合物顯示出抗氧化、保護(hù)心血管、神經(jīng)保護(hù)、調(diào)節(jié)糖脂代謝等藥理作用，在抗氧化損傷方面也體現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[36-39]。多酚類(lèi)物質(zhì)同樣具有抗氧化損傷、預(yù)防2 型糖尿病、調(diào)節(jié)脂代謝等藥理作用[40-41]。研究表明，植物提取物鞣花酸可直接清除活性氧自由基，抑制氧化應(yīng)激、強(qiáng)抗氧化酶活性及基因表達(dá)，減少DNA 損傷[42]。植物甾醇如β-谷甾醇可通過(guò)促進(jìn)膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的生化合成達(dá)到預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用。此外，β-谷甾醇還具有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)體內(nèi)激素和調(diào)節(jié)代謝的作用[43-44]。三萜類(lèi)化合物是一類(lèi)具有多種生物活性的天然產(chǎn)物，具有抗炎、抗菌、保護(hù)肝腎、降血糖和抗腫瘤等藥理作用[45]。本研究從刺梨葉中解析出的三萜類(lèi)成分刺梨苷通過(guò)抗氧化作用能夠明顯改善大鼠腦部組織的損傷，降低血清丙二醛水平，提升血清超氧化物歧化酶含量，從而改善急性高原缺氧癥狀，其抗氧化損傷方面的藥理作用或可對(duì)臨床應(yīng)用產(chǎn)生新的價(jià)值[46]。由以上幾種存在于刺梨葉中的主要活性成分的藥理作用可以看出，刺梨葉的藥理作用可能不僅局限于簡(jiǎn)單的消食功效，其在抗氧化和調(diào)節(jié)代謝方面也能發(fā)揮一定療效，有待深入研究。