羥丙基甲基纖維素對鹽酸小檗堿腸道微環境調控效應的影響△

吳晨陽，黎迎，鄒佩志，鄭婷婷，張運，董政起

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

鹽酸小檗堿（BBR）是主要從黃連及黃檗中分離出來的生物堿，具有多重生物學功能。BBR 極性小、溶解度低、滲透性差、血藥濃度極低、生物利用度低[1]，但其在治療胃腸道炎癥[2]、代謝相關疾病[3]（如2 型糖尿病[4]）、阿爾茨海默病及帕金森癥[5]等方面具有顯著的藥效。按照傳統藥理學觀念，藥物需靠有效成分入血并達到一定濃度才可發揮治療作用，這個理論尚無法全面闡釋BBR 的多種藥理活性。目前的研究指出，除少量吸收入血以外，BBR發揮上述藥效的另一關鍵原因可能是其吸收差而在腸道內大量富集所帶來的菌群調節作用[6]，如提高短鏈脂肪酸（特別是丁酸）產生菌的相對豐度等[7]。因此，充分發揮BBR 的菌群調節作用或可作為提高其藥效的一種關鍵手段。

隨著越來越多的研究聚焦在腸道健康，腸道菌群與外界及機體關系的黑匣子逐漸被打開[8]，研究發現，腸道微生態的穩定與否[9]及日常飲食習慣[10]會對腸道功能產生多方面的影響，如腸道滲透性與腸道屏障功能。研究表明，腸道滲透性與多種疾病相關，關注腸道滲透性對于疾病預防及治療至關重要。據報道，腸道屏障輕度受損會引起腸道弱炎癥[11]，促炎細胞因子表達量升高，機體易感程度變大，易于受到黏附侵襲性大腸埃希氏菌感染，從而導致腸道紊亂進一步加劇，腸道滲透性增強，有害小分子進入機體，加劇機體炎癥[12]。其中腸道屏障功能受損的初始表現有腸道黏液層變薄[13]，從而引起黏膜層結構等損傷，腸上皮出現囊腫的概率變大。

羥丙基甲基纖維素（HPMC）作為一種藥用輔料記載于《中華人民共和國藥典》2020 年版[14]，在生物醫藥行業有多方面的應用，主要用于包衣材料、膜材料及緩釋制劑的控釋材料[15]，如作為片劑中的黏附材料[16]、改進阿司匹林腸溶片的包衣材料[17]、藥物緩釋片的骨架材料[18-19]。一方面，作為最常用的親水載體之一，HPMC在制劑研究中得到廣泛青睞。研究表明，在口腔黏膜藥物遞送系統中，HPMC 可增強藥物黏附于口腔黏膜的能力，從而增加藥物與口腔黏膜接觸的時間，以更好地發揮藥效[20]。另有研究表明，作為原位凝膠的基質之一，隨著HPMC F4M 濃度的增加，其凝膠黏性增加，同時延緩藥物釋放的程度也相應增加[21]。另一方面，作為不可發酵的膳食纖維，HPMC 被認為是一種潛在的益生元纖維[22]，已有報道指出其可調節高脂喂養小鼠的腸道菌群Alpha多樣性及菌群組成[23]。

目前，對藥用輔料的功能認知逐漸深入，傳統意義上選用藥用輔料的標準不斷被刷新，已經不局限于選擇安全性高、生物相容性好、不與活性物質相互作用的輔料，其與腸道菌群的相互作用也逐漸被納入考慮范疇，有研究報道多種藥用輔料可通過調節菌群影響機體健康及藥物治療效果[24-28]，同時，輔料自身的理化性質對藥物的菌群調節作用的影響也應得到充分重視。與BBR 相似，HPMC 在人體內不易被代謝，同時具有高黏性，可使BBR 在腸道內滯留，這為藥物與腸道菌群充分接觸從而更好地發揮菌群調節作用創造了更為有利的條件。本研究以HPMC 為例，對其與BBR 物理混合使用時對腸道微環境的調控效應進行初步探索，也為類似性質的輔料（如果膠、卡波姆和海藻酸鈉等）通過腸道菌群調控影響BBR藥效方面的研究提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級雄性C57BL/6 小鼠40只，體質量18～20 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2016-0006，飼養于北京協和醫學院藥用植物研究所SPF級動物房，小鼠飼養條件為恒溫恒濕，環境溫度為（22±2）℃，相對濕度為（50±5）%，12 h/12 h 光暗交替，正常給予常規飼料及純凈水。本研究所涉及的動物實驗均按照北京協和醫學院動物倫理程序和規范處理，審批號為SLXD-20201221013。

1.2 儀器

Secura224-1CN 型電子分析天平（德國Satrorius公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SP131010-33Q型加熱磁力攪拌器（美國Barnstead Thermolyne公司）；L550型臺式低速大容量離心機（德國Eppendorf 公司）；TL-48R 型粉碎研磨儀（上海萬柏生物科技有限公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；NanoDrop 2000型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher公司）；GeneAmp?9700 型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI 公司）；Quantus?型微型熒光計（美國Promega 公司）；Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺（美國Illumina 公司）；Aperio CS2 型緊湊型臺式玻片掃描儀（德國徠卡顯微系統）。

1.3 試藥

HPMC F4M（批號：D180I8Q012，美國陶氏化學）；BBR（批號：ZLSC2020072617，純度＞98%，南京澤朗有限公司）；E.Z.N.A.?soil DNA kit（美國Omega Bio-Tek公司）；AxyPrep DNAGel Extraction Kit（美國Axygen 公司）；瓊脂糖（西班牙Biowest 公司）；Quantus?Fluorometer（美國Promega 公司）；NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit（美國Bioo Scientific公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；引物由北京易科拜德生物技術有限公司合成。

2 方法

2.1 溶液制備

配制HPMC 水溶液（40 mg·mL-1），經24 h 常溫磁力攪拌，待溶脹至澄清透明黏稠狀液體后備用；配制BBR 水溶液（15 mg·mL-1），超聲30 min（100 W，40 kHz），得混懸液。先配制HPMC 的水溶液基質，再將BBR 加入基質中，得HPMC 質量濃度為40 mg·mL-1、BBR 質量濃度為15 mg·mL-1的混合溶液，經24 h常溫磁力攪拌分散均勻后待用。

2.2 分組與給藥

將24 只C57BL/6 小鼠進行1 周的適應性飼養，之后隨機分組，分為對照組、HPMC（400 mg·kg-1）組、BBR（150 mg·kg-1）組、HPMC 與BBR 物理混合（H+B，400 mg·kg-1+150 mg·kg-1）組，每組6只。灌胃給藥，每日給藥1 次，對照組小鼠灌胃給予蒸餾水，共給藥3 周。其中，BBR 的給藥劑量由文獻調研[29]得到，選取BBR 常用給藥劑量區間內的中等值進行探索，HPMC 的劑量是預實驗篩選出可口服給藥的最大劑量。

2.3 結腸病理學檢查

小鼠頸椎脫臼處死，取遠端結腸組織，去除內容物，以4%組織細胞固定液進行固定，石蠟包埋，以梯度體積分數酒精進行洗脫，按照標準程序切厚度為3.5 μm 的薄片，采用HE 染色，每張切片隨機選取3個視野于光學顯微鏡下進行觀察。

2.4 腸道菌群高通量測序分析

藥物干預3 周后收集各組小鼠新鮮糞便，放置于凍存管中，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存，備用。取小鼠糞便，采用E.Z.N.A.?soil DNA kit 進行微生物群落總DNA 抽提，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取質量，測定DNA 濃度和純度。使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16S rRNA 基因V3～V4 可變區進行PCR 擴增。將同一樣本的PCR 產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus?Fluorometer 對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 進行建庫，利用Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺進行測序。

2.5 數據統計

因H+B 組1 只小鼠意外死亡，故參與數據統計的各組樣本數目情況為對照組6 只，HPMC 組6 只，BBR 組6 只，H+B 組5 只。結腸組織切片觀察及厚度標記使用CaseViewer 軟件進行分析。菌群操作分類單元（OTUs）作圖使用R 3.2.0 軟件及GraphPad Prism 軟件。菌群Alpha 多樣性分析采用Observed-OTUs，Chao1 豐富度指數、Shannon 多樣性指數、Simpson多樣性指數、Beta多樣性分析采用非度量多維標度（NMDS）分析。數據分析采用單因素方差分析（ANOVA）、非參數Tukey 檢驗。以P＜0.05為組間差異具有統計學意義。

3 結果與討論

3.1 HPMC和BBR對小鼠結腸組織的影響

結腸組織HE染色結果表明，各組小鼠結腸組織黏膜結構完整，腸絨毛無明顯缺損，且未觀察到明顯水腫，說明各組小鼠均未出現明顯炎癥反應（圖1）。

圖1 各組小鼠遠端結腸組織HE染色切片

對各組小鼠結腸組織黏膜層、黏膜下層及肌膜層（漿膜層與肌層的厚度總和）的厚度進行分析，結果表明，干預3 周后，各組中較為關鍵的結腸黏膜層厚度未發生顯著變化（表1）。由結腸組織HE染色結果和對腸組織各部分厚度的分析，可得HPMC和BBR的干預未對結腸機械屏障造成顯著影響。

表1 小鼠結腸組織黏膜層、黏膜下層及肌膜層厚度（, n=3）

表1 小鼠結腸組織黏膜層、黏膜下層及肌膜層厚度（, n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

3.2 HPMC 和BBR 對小鼠腸道菌群多樣性及組成的影響

3.2.1 樣本OTUs 重疊情況 采用韋恩圖（圖2）對各組小鼠腸道菌群中特有OTUs和共有OTUs進行分析，結果表明，對照組、HPMC 組、BBR 組、H+B組OTUs分別為2026、2095、299、161條。HPMC組特有OTUs為323條，多于對照組（267條）、BBR組（96 條）、H+B 組（7 條）。HPMC 組與對照組共有的OUTs為1577條，BBR組與對照組共有的OUTs為7 條，BBR 組與H+B 組共有的OUTs 為22 條。說明從OTUs 數目和特有成分上來看，HPMC 組與對照組相似性更高，而BBR組與H+B組相似性更高。

圖2 各組小鼠腸道菌群樣本OTUs重疊結果韋恩圖（n=5～6）

3.2.2 Alpha 多樣性 對各組小鼠腸道菌群測序所得的OTUs序列進行Alpha多樣性分析（圖3），BBR組和H+B 組可觀察到的物種數顯著低于對照組及HPMC 組（P＜0.001）。對由OTUs 數量計算所得的Chao1、Shannon、Simpson 指數進行分析。與對照組相比，HPMC組除組內均勻度降低外，Shannon指數未發生明顯變化；BBR 組組內均勻度較好，Shannon指數顯著降低（P＜0.001）。與BBR組相比，H+B 組Shannon 指數進一步降低，且差異具有統計學意義（P＜0.05），Simpson 指數顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05），即與HPMC 合用增強了BBR 的抗菌能力。推測這與HPMC 的物理性質有關，如代謝惰性、高黏性、酶抑制和膠體保護等。其中，酶抑制的特性可以起到保持黏度穩定性的作用，使得HPMC 在不同的環境中均可以保持出色的黏度。經過長時間的物理混合，HPMC 充分溶脹，使BBR 分散均勻，防止其在溶液底部形成沉淀，HPMC 與水接觸后可形成透明、柔韌的膜[30]，當經過胃和小腸時對BBR 進行包裹保護，當到達結腸后，HPMC 與BBR 的物理混合體系使得BBR 與腸道菌群接觸得更加均勻，因而促進了BBR 降低腸道菌群Alpha多樣性的趨勢。

圖3 各組小鼠腸道菌群OTUs序列Alpha多樣性指數分析（n=5～6）

3.2.3 Beta 多樣性 繪制NMDS 圖分析對照組、HPMC 組、BBR 組及H+B 組的組間差異程度，進行Beta 多樣性分析，不同組之間的分離程度越大，說明組間差異越明顯。結果表明，HPMC 組與對照組距離較近；BBR 組、H+B 組與對照組距離均較遠，差異較大；BBR 組與H+B 組距離較近，差異較小（圖4）。BBR 組與H+B 組的菌群組成明顯不同于其他2組，BBR干預有效發揮了菌群調節作用。

圖4 各組小鼠腸道菌群OTUs序列Beta多樣性分析（n=5～6）

3.2.4 腸道菌群在門水平上的組成 在門水平上，各組小鼠腸道菌群的組成中優勢菌群包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）及疣微菌門（Verrucomicrobia）（圖5A）。對照組擬桿菌門的相對豐度為57.11%，BBR 組為43.75%，H+B組為35.48%（圖5B）；對照組厚壁菌門的相對豐度為33.57%，BBR 組為24.22%，H+B 組為16.85%；對照組放線菌門的相對豐度為3.67%，BBR 組為0.01%（P＜0.05），H+B 組為0.01%（P＜0.05）。與之相反，BBR 干預可顯著富集變形菌門及疣微菌門。對照組變形菌門的相對豐度為2.00%，BBR 組為11.99%（P＜0.001），H+B組為14.65%（P＜0.001）；對照組疣微菌門的相對豐度為2.78%，BBR 組為19.63%（P＜0.05），H+B 組為33.00%（P＜0.001），H+B 組富集疣微菌門的能力優于BBR 組。在這幾種優勢菌門的變化中，疣微菌門的漲幅最為突出，推測這與屬于疣微菌門的艾克曼菌屬（Akkermansia）的相對豐度大幅提高有密切關聯。

圖5 各組小鼠腸道菌群在門水平的組成（n=5～6）

3.2.5 腸道菌群在屬水平上的組成 在屬水平上，對照組毛螺菌屬（Lachnospiraceae）的相對豐度為1.219 0%，BBR組為0.003 0%（P＜0.05），H+B組為0.0006%（P＜0.05）；對照組瘤胃菌屬（Ruminococcaceae_UCG-014）相對豐度為1.430%，BBR 組為0.013%，H+B 組為0；對照組另支菌屬（Alistipes）的相對豐度為1.319%，BBR 組為0.074%（P＜0.05），H+B組為0；對照組其他unidentified 菌屬的總相對豐度為70.92%，BBR 為34.73%（P＜0.001），H+B 組為12.88%（P＜0.001）；與BBR 組相比，H+B 組顯著降低（P＜0.05）。對于以上各菌屬，HPMC 組均未發生顯著性變化，BBR 使其相對豐度產生不同程度的下降趨勢，H+B 組與BBR 組變化趨勢一致，整體來看，以上所提到的菌屬除unidentified 菌屬以外，其余菌屬變化幅度均較小，不超過2%（圖6）。

圖6 各組小鼠腸道菌群在屬水平的組成（n=5～6）

BBR 對部分菌屬可產生富集作用，如布勞特氏菌屬（Blautia）、艾克曼菌屬和埃希氏菌-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）。對照組布勞特氏菌屬的相對豐度為1.525%，BBR 為12.720%（P＜0.001），H+B 組為8.717%（P＜0.05）。布勞特氏菌屬是產丁酸的主要菌種，屬于短鏈脂肪酸產生菌，短鏈脂肪酸的產生可促進機體內腸道緊密連接蛋白的形成及腸道有益菌種的生長[31]，可緩解因腸道滲透性增大引起的免疫炎癥，起到良好的修復及保護腸道屏障功能的作用；對照組艾克曼菌屬的相對豐度為2.776%，BBR 組為19.630%（P＜0.05），H+B 組為33.000%（P＜0.001），增強了BBR 富集艾克曼菌屬的作用。作為一種明星菌屬，艾克曼菌屬屬于疣微菌門，BBR 顯著上調了疣微菌門和艾克曼菌屬的豐度，這與先前的研究結果一致[32]，艾克曼菌屬是黏液定殖微生物中的主要菌屬，與黏液層發揮對腸道組織的保護作用密切相關。有研究表明，克羅恩病及潰瘍性結腸炎患者腸道內艾克曼菌屬相對豐度下降，與疾病狀態呈負相關[33]，因此BBR 富集此菌可能是其修復黏液層厚度的關鍵原因[34]。對照組埃希氏菌-志賀菌屬的相對豐度為0.002%，BBR 組為10.150%（P＜0.001），H+B組為11.890%（P＜0.001）。以上各菌屬，HPMC 干預均未使菌屬相對豐度差異有統計學意義。值得注意的是，對照組薩特氏菌屬（Parasutterella）的相對豐度為0.961%，HPMC 組為0.116%（P＜0.001），與對照組相比，BBR 組薩特氏菌屬的相對豐度無明顯變化，H+B 組則產生輕微下降趨勢，薩特氏菌屬的相對豐度為0.441%。副薩特氏菌屬參與膽汁酸穩態代謝維持，其穩態失衡后或對腸道屏障帶來不利影響[35]，HPMC 組該菌相對豐度輕度下降，與BBR 合用后恢復正常，避免出現腸道微生態紊亂。

綜合來看，無論是從Alpha 多樣性的變化還是腸道菌群的組成變化來看，與HPMC 物理混合使用后，BBR 的菌群調節作用均得到正向促進，究其原因，很大程度上是由于HPMC 的高黏度，研究選用的HPMC F4M 在2% 的濃度下黏度即可達到4000 mPa·s，在本研究中，選取4%的HPMC。已有研究指出HPMC F4M 可使藥物更好地黏附在口腔黏膜[20]，推測4%的高黏性HPMC 與BBR 物理混合后，使BBR充分黏附于腸道黏膜，增加了BBR與定殖在腸道黏液層上的腸道菌群接觸的概率和時間，從而直接促進了BBR 的菌群調節作用。同時，研究表明HPMC F4M 可延緩藥物的釋放[21]，推測其可增加BBR 在腸道內的滯留，某種程度上也可促進其與腸道菌群的相互作用。另一方面，從BBR 吸收入血發揮作用的角度考慮，由于HPMC 是一種親水性高分子，當其與溶解度較低的BBR 物理混合后，存在提高BBR 溶解度的可能，從而促進BBR 入血發揮藥效。

4 結論

本研究對BBR與HPMC合用及BBR單獨干預可能引起的小鼠腸道菌群及腸道微生態變化進行初步探究，分析得出，HPMC 單獨使用未對小鼠腸道微生態產生明顯影響，HPMC 與BBR 物理混合后起到對BBR自身功能的正向促進作用，可增強BBR的廣譜抗菌能力，同時增強BBR 富集艾克曼菌屬的作用，推測這與HPMC 與BBR 物理混合使用時增強其黏附于腸道黏膜及延緩BBR釋放，從而促進BBR與腸道菌群充分接觸以更好地發揮菌群調節作用密切關聯。除此之外，還可考慮具有相同黏度，但甲氧基、羥丙基取代度不同的其他型號HPMC 如E4M、K4M 等對BBR 腸道微生態調控作用的影響的差異，從而探究黏性以外的作用機制。另外，果膠、卡波姆、海藻酸鈉等可作為凝膠基質的藥用輔料也存在影響BBR 腸道微生態調控效應的潛在可能，未來可開展相關實驗對此進行探究，以從全新的角度考量制劑研究中藥用輔料的選擇標準。