草甘膦對黨參生長根腐病及根際土壤微生物的影響△

楊姍姍，仲彩萍，王儀，3，劉紫祺，3，邵慧慧，3，孫新榮，高微微，3*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.甘肅省定西市渭源縣農業技術推廣中心，甘肅 定西 748200；

3.中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193

隨著中藥材種植勞動力成本的增加，草害問題逐漸凸顯，而除草劑的應用對中藥材產量及質量的影響研究相對缺乏。黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.為桔梗科黨參屬多年生草本植物，是常用大宗藥材之一，具有健脾益肺、養血生津之功效[1]。甘肅省渭源縣是中國黨參之鄉，主產的白條黨參是市場上黨參藥材的主流產品[2]。根據筆者調查，為解決黨參栽培種植中的草害問題，近年來，甘肅黨參產區開始應用除草劑。草甘膦（glyphosate）是一種高效、低毒、廣譜的非選擇性除草劑，一般在前茬作物收獲后施用，目前，尚無草甘膦對黨參影響的報道。本研究就甘肅渭源縣使用草甘膦對黨參生長、病害發生、內在質量及土壤微生物群落的影響展開調查，以期為黨參種植中除草劑的使用提供參考。

1 材料

1.1 樣品

樣品由甘肅省定西市渭源縣農業技術推廣中心孫新榮高級農藝師鑒定為黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.的根。

1.2 儀器

ABT 220-4M型電子分析天平（上海島韓實業有限公司）；PHS-25 型pH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；DZ-9001 型振蕩器（常州梅香儀器有限公司）；1200 型高效液相色譜儀及二極管陣列檢測器（DAD）、Spectr AA 55 型原子吸收分光光度計（美國Agilent 公司）；721 型紫外-可見分光光度計（賽默飛世爾科技公司）；Miseq-300 型基因測序儀（美國Illumina 公司）；TAS-990F 型火焰分光光度計（深圳市億鑫儀器設備有限公司）。

1.3 試藥

對照品黨參炔苷（批號：SL8240，純度＞98%）、D（+）-無水葡萄糖（批號：1122A0231，純度≥98%）均購于北京索萊寶科技有限公司；乙腈［色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；濃硫酸、硼酸、硝酸、高氯酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；苯酚（批號：P815401，上海麥克林生化科技有限公司）；氫氧化鈉（批號：M32207，上海邁瑞爾化學技術有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 調查區概況

調查區位于甘肅省定西市渭源縣清源鎮馬家窯村，前茬作物為蠶豆，土壤基礎肥為有機質19.26 g·kg-1、全氮1.35 g·kg-1、全鉀13.6 g·kg-1、全磷2.76 g·kg-1、全鈣43.84 g·kg-1、全鐵32.15 g·kg-1、全鎂11.94 g·kg-1，pH 為8.13。調查區內有施用草甘膦處理組（GP）面積300 m2，空白對照組（CK）面積250 m2。GP 于2019 年8 月蠶豆收獲后在雜草葉面噴施74.70%草甘膦銨鹽（劑量為2.25 kg·hm-2），2020年4月種植黨參。

2.2 檢測樣品采集

2020 年7 月下旬黨參生長季調查黨參存苗數，2020 年10 月中下旬黨參收獲時調查黨參生長及發病情況。GP 及CK 分別測定3 個點，每個點計數1 m2的黨參的存苗數，稱量地上及地下部鮮質量，統計根腐病發病率及病情指數；將黨參根60 ℃干燥箱中干燥，粉碎過60 目篩，室溫密封保存，用于測定黨參炔苷及多糖含量。同時，挖取土壤樣品，去除地表1～5 cm 的表土，挖取根5 cm 范圍內距地表5～15 cm 處的土壤作為根際土壤，密封，4 ℃低溫保存，3 d 內轉移至-80 ℃保存，1 個月內測定根際土壤微生物組（北京奧維森基因科技有限公司）。

2.3 黨參根腐病分級標準及病情指數計算

黨參根腐病嚴重度分級標準參照孫新榮等[3]報道方法。0 級：不發病；1 級：地上莖葉1/2 以下萎蔫，根部外觀正常，內部維管束1/2 以下出現黃色病變，或地上莖葉1/2 以下枯黃，莖葉基部和根部出現1～3個病斑；3 級：地上莖葉1/2 以上萎蔫，根內部維管束1/2（含1/2）以上出現黃色或紅色病變，或地上莖葉1/2（含1/2）以上枯黃，莖葉基部和根部出現3個以上病斑并開始腐爛；5 級：地上莖葉全部青枯，根部維管束全部變為黃色或紅色，出現軟腐，或地上莖葉全部枯黃，根部腐爛在1/2 以下；7 級：地上莖葉枯死，根部全部腐爛。病情指數按公式（1）計算。

2.4 黨參中成分含量測定測定

黨參炔苷的提取和測定：參照高石曼等[4]報道方法，精密稱定黨參細粉1 g，加70%甲醇30 mL，超聲提取2 次，每次30 min。色譜柱為Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），進樣量為10 μL；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，5%B；8～10 min，5%～8%B；10～25 min，8%～15%B；25～26 min，15%～20%B；26～36 min，20%B；36～48 min，20%～37%B；48～55 min，37%～60%B；55～70 min，60%B；70～80 min，60%～90%B；80～90 min，90%B）；流速0.8 mL·min-1；檢測波長為267 nm；柱溫為30 ℃。

多糖的提取和測定：參照高石曼等[4]報道方法，精密稱定黨參細粉0.25 g，加入80%乙醇150 mL，加熱回流提取1 h，濾過，殘渣加水150 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液定容至250 mL。精密量取上述液體2 mL 用水定容至10 mL，取1 mL 加入等體積5%苯酚及濃硫酸5 mL，搖勻，于紫外-可見分光光度儀490 nm下測定吸光度。

2.5 黨參根際土壤微生物測定

取土壤樣本0.4 g，使用MOBIO PowerSoil?DNA提取試劑盒提取土壤總DNA。細菌群落用通用正向引物（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和反向引物（5'-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴增16SrRNA基因的V3-V4區；真菌群落用通用正向引物（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和反向引物（5'-TGCGTTCTTCATCGATGC-3'）擴增內轉錄間隔區（ITS）1區。使用Illumina 平臺對聚合酶鏈式反應（PCR）產物進行雙端測序并分析[5]。

2.6 數據處理

對原始數據進行篩選，去除測序和建庫過程中人為添加的引物、接頭及測序過程中產生的低質量序列（quality score＜20）。采用Mothur V1.37.0軟件去除＜200 bp 的原始片段。采用USEARCH V8.1.1861 軟件參照Gold 和UNITE 數據庫移除嵌合體。采用UPARSE 軟件將序列按照97%的相似度聚類為操作分類單元（OTU）。為了減少對稀有OTU 的過度估計，從隨后的分析中去除Singletons OTUs（即樣品中僅出現1次的OTU）。利用Ribosomal Database Project（RDP）數據庫對具有代表性的OTU序列進行比對和注釋。采用QIIME V1.8軟件分析Coverage、Chao1、Simpson和Shannon指數[6]。用獨立樣本t檢驗分析比較各處理間生長指標、病害指標及群落結構指標差異的顯著性（閾值設為0，以P＜0.05為差異有統計學意義）。

3 結果與分析

3.1 草甘膦對黨參存苗及生長的影響

調查結果發現，施用草甘膦對生長季（7月）黨參存苗數影響較小但可顯著降低收獲季（10 月）黨參的存苗數（P＜0.05），與CK 相比，存苗數下降23.08%；在黨參收獲時，GP 黨參根生物量降低35.93%，地上部分的生物量降低5.03%，但與CK相比差異無統計學意義（圖1）。

圖1 草甘膦對黨參生長期1 m2的黨參存苗數及收獲期每平方米鮮質量的影響（, n=3）

3.2 草甘膦對黨參根腐病發生的影響

采用根腐病病情指數評價黨參收獲時根腐病發生情況，結果顯示，GP 平均發病率和平均病情指數與CK 相比均顯著上升（P＜0.05），分別提高了34.51%和34.81%（圖2）。施用草甘膦加重了根腐病的發生。

圖2 草甘膦對黨參根腐病發生的影響（, n=3）

3.3 草甘膦對黨參中成分含量的影響

黨參炔苷和多糖含量測定結果顯示，GP 黨參炔苷平均質量分數與CK相比減少9.87%，但差異無統計學意義；多糖質量分數顯著下降（P＜0.05），比CK降低42.10%（圖3）。這說明草甘膦的使用主要導致多糖含量下降，對黨參炔苷含量也有一定影響。

圖3 草甘膦對黨參炔苷和多糖質量分數的影響（, n=3）

3.4 草甘膦對黨參根際土壤微生物多樣性的影響

對黨參根際土壤樣品細菌16S rDNA 的V3-V4區、真菌ITS 高通量測序結果進行分析，分別得到336 234、505537條優化序列，用聚類的方法生成20208、3331個OTU。OTU 的聚類分析覆蓋了黨參根際土壤微生物的97%以上，表明該測序結果能反應黨參根際土壤微生物群落的變化情況。

α-多樣性的分析結果表明，對于細菌，GP 的Chao1 指數及Shannon 指數有所降低，Simpson 指數無變化；對于真菌，GP 的Chao1 指數及Simpson 指數增加，Shannon 指數降低，但差異無統計學意義，說明草甘膦處理對黨參根際土壤微生物α-多樣性影響不大（表1）。

表1 黨參根際土壤微生物的α-多樣性

β-多樣性指數主坐標分析（PCoA）顯示，GP根際土壤細菌群落與CK 重合（R=0.950 6，P＞0.05，圖4A），根際真菌群落與CK 相鄰（R=0.074 1，P＞0.05，圖4B），草甘膦對黨參根際土壤微生物群落組成無顯著影響。

圖4 黨參根際土壤細菌和真菌微生物OTU水平PCoA

3.5 草甘膦對黨參根際土壤細菌群落組成和豐度的影響

對黨參根際土壤樣品中細菌群落組成進行分析，共檢測到41個門。其中，變形菌門（Protebacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）、綠彎菌門（Chloroflexi）和芽單胞菌門（Gemmatimonadota）的相對豐度均大于1%，是黨參根際土壤中的優勢菌門，其他35個門的豐度占比均小于1%（圖5A）。與CK相比，Chloroflexi的相對豐度降低了19.97%、Bacteroidota的相對豐度增加27.37%，但差異無統計學意義。

對所有相對豐度＞5%的5個細菌優勢菌目進行分析，結果顯示，草甘膦處理組中Vicinamibacterales、伯克霍爾德氏菌目（Burkholderiales）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）的相對豐度分別比CK增加了5.56%、20.15%和47.96%，而根瘤菌目（Rhizobiales）和芽單胞菌目（Gemmatimonadales）的相對豐富度分別下降了10.31%和5.93%，其中Burkholderiales和Sphingomonadales 差異有統計學意義（P＜0.05，圖5B）。

圖5 黨參根際土壤細菌群落在門和部分目水平上的相對豐度（, n=3）

3.6 草甘膦對黨參根際土壤真菌群落組成和豐度的影響

從綱水平對黨參根際土壤樣品中真菌群落組成進行分析，共檢測到40 個綱，其中，盤菌綱（Pezizomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、座囊菌綱（Dothidemmycetes）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）和銀耳綱（Tremellomycetes）5個綱的相對豐度均大于1%，是黨參根際土壤中的優勢菌綱，其余35個綱的相對豐度占比均小于1%（圖6A）。與CK相比，GP 中Mortierellomycetes、Dothidemmycetes 和Tremellomycetes的相對豐度增加了23.36%、3.10%和8.79%，Sordariomycetes和Pezizomycetes 的相對豐度降低了17.23%和42.09%，但差異無統計學意義。從屬水平對黨參根際土壤樣品中相對豐度＞5%的4個真菌優勢菌目進行分析，結果顯示，GP中被孢霉屬（Mortierella）、Titaea和赤霉屬（Gibberella）的相對豐度分別增加了23.36%、4.26%和17.78%，毛殼菌屬（Chaetomium）的相對豐度下降了32.01%，但與CK相比，差異無統計學意義（圖6B）。

圖6 黨參根際土壤真菌群落在綱和部分屬水平上的相對豐度（, n=3）

4 討論

草甘膦是世界上使用最廣泛的除草劑之一，具有高效、低毒、廣譜等特點，易與土壤有機物或礦物質結合而失去活性，被認為是一種相對安全的除草劑[7]。然而，筆者在甘肅黨參產區調查時發現，當地施用草甘膦8 個月后種植黨參，仍然出現生長勢減弱的現象。本研究結果證實，草甘膦可顯著降低收獲季黨參的存苗數、加重根腐病的發生，并降低黨參炔苷和多糖的含量。由于草甘膦在土壤中的半衰期一般只有3～40 d[8]，從2019 年8 月前茬作物蠶豆收獲后使用到2020 年4 月種植黨參間隔8 個月，理論上草甘膦已完全降解，草甘膦對黨參不存在直接抑制作用，7 月田間存苗數的調查結果支持了上述推測。有研究報道，草甘膦可導致玉米和大豆根際土壤中Proteobacteria 相對豐度增加、Acidobacteria 相對豐度降低[9]。因此，筆者認為草甘膦對黨參的影響可能來源于間接的土壤微生物的改變。

土壤微生物多樣性是評價土壤微生物群落特征和穩定性的重要指標，土壤微生物組成與植物的生長與健康密切相關[10]。本研究發現，雖然GP 與CK相比根際土壤細菌及真菌多樣性差異無統計學意義，但可顯著增加根際土壤細菌中Burkholderiales和Sphingomonadales 的相對豐度。以往研究表明，Burkholderiales 包含多種植物病原，如伯克霍爾德菌Burkholderia plantarii是引起水稻秧苗細菌性立枯病的重要病原菌之一，其侵染性、繁殖力及適應性均很強，嚴重威脅中國水稻生產[11-13]；Sphingomonadales 可作用于有機磷化合物的生物降解，具有很好的農藥降解能力[14]，其相對豐度增加可能與草甘膦的降解相關。本研究基于所有微生物OTUs 計算的多樣性指數，在CK 與GP 差異無統計學意義，但部分細菌豐度發生顯著改變，導致群落結構發生一定變化。

施用草甘膦導致的根腐病加重，與土壤微生物雖然有一定關系，但很可能只是原因之一，其他作用因子還有待進一步研究探討。本次調查樣地的草甘膦用量為通用的劑量，鑒于草甘膦對黨參的綜合影響，黨參種植地應盡量避免除草劑草甘膦的施用。