異地種植對PA型紫蘇葉酚酸黃酮類成分及揮發(fā)油的影響

落艷嬌，張琛武，郭佳琪，李衛(wèi)萍，姚宇，申國安，徐超群，索風梅，郭寶林*

1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.山西藥科職業(yè)學院，山西 太原 030031

紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.在我國分布范圍廣泛，生長環(huán)境差別很大。紫蘇葉作為常用中藥，具有解表散寒、行氣和胃等功效，用于風寒感冒、咳嗽嘔惡、妊娠嘔吐、魚蟹中毒，常作為食用香料、食物色素和蔬菜[1]。其主要含有揮發(fā)油、酚酸和黃酮類成分，其中揮發(fā)油可作為原料直接入藥起到清熱解表作用，或者用作香料和食物防腐；酚酸類成分具有抗炎、抗菌、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁、保肝、降血糖和調(diào)血脂等作用[2]；黃酮類成分具有顯著的抗炎、抗氧化、抗過敏和調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[3]。紫蘇葉中揮發(fā)油也稱為紫蘇葉油，因主要成分類型的差異分為紫蘇酮（PK）型、紫蘇醛（PA）型、紫蘇烯（PL）型、香薷酮（EK）型等，也將含有該類揮發(fā)油的紫蘇稱為相應的化學型。其中，只有PA 型紫蘇是符合《中華人民共和國藥典》2020年版紫蘇葉項下要求的類型[4-5]。國內(nèi)PA型紫蘇的資源較為缺乏[5]，是值得深入研究和開發(fā)的資源類型。本課題組前期研究了20 份紫蘇種質(zhì)在2 個區(qū)域種植對PK型、PA型、PL型、EK型等多種化學型構成成分的影響，發(fā)現(xiàn)化學型基本沒有變化[6]。本研究遴選出5 份PA 型紫蘇種質(zhì)，研究其在3 個不同區(qū)域種植后揮發(fā)油含量和組成，以及8 個主要酚酸和黃酮類成分的變化，以探究不同環(huán)境對其可能產(chǎn)生的影響及未來品種推廣可能面臨的質(zhì)量變化。

1 材料

1.1 樣品

所用5 份PA 型紫蘇材料（編號：AG-12、BJ-2、JS-1、ZhJ-z1 和RB-1）經(jīng)中國醫(yī)學科學院郭寶林研究員鑒定為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的種植類型變種回回蘇P.frutescensvar.crispa（Thunb.）Hand.-Mazz.，于2018 年9 月，各地各種質(zhì)植株主莖頂序現(xiàn)序時，在上午8—11 時采收。每個種質(zhì)取3份樣品，每份來自于5個個體全株葉片的混合，鮮品不少于300 g，除去雜質(zhì)后陰干備用。

1.2 儀器

ACQUITY 型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；New Classic MS 型十萬分之一天平（上海Mettler-Toledo 公司）；FA2014N 型分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GZX-9070 MBE 型數(shù)顯鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；Trace 1310-ISQ 型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo Finnigan公司）；EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、CA-1111型循環(huán)式真空泵（上海愛朗儀器有限公司）。

1.3 試藥

對照品野黃芩素-7-O-二葡萄糖醛酸苷（SDG，批號：102782）、木犀草素-7-O-二葡萄糖醛酸苷（LDG，批號：102779）、芹菜素-7-O-二葡萄糖醛酸苷（ADG，批號：102780）均購于江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，咖啡酸（CA，批號：160815）、迷迭香酸（RA，批號：160724）均購于南京森貝伽生物科技有限公司，野黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷（SG，批號：1445）、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷（LG，批號：3187）、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷（AG，批號：3075）均購于上海詩丹德標準技術服務有限公司，所有對照品經(jīng)面積歸一化法測定純度均大于98%；乙腈、正己烷（色譜純，美國Fisher 公司）；水為蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 田間試驗

將5 份PA 型紫蘇材料于2018 年4 月分別在北京市海淀區(qū)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所南園種植試驗田、甘肅省慶陽市正寧縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園種植試驗田、安徽省阜陽市太和縣雙浮鎮(zhèn)水蛭繁殖基地種植試驗田栽培。5月下旬至6月上旬（種苗株高至10 cm）選擇高度一致、生長健壯的種苗，于陰天落日時分進行移栽，種植密度為5500 株/畝（1 畝≈666.67 m2，株行距：30～40 cm），每種材料種植5行，每行12 株。3 個地點土壤均中上等肥力，常規(guī)水肥管理。

北京試驗田位于北京市海淀區(qū)馬連洼北路藥用植物研究所院內(nèi)。試驗田地勢平坦，土壤類型為砂壤土，基礎肥力中等偏上，位于N39°47'，E116°25'，海拔為50 m，屬于溫帶半濕潤大陸性季風氣候，年平均氣溫8～12 ℃，年降水量約600 mm，年日照時數(shù)2778 h，無霜期190 d左右。

甘肅試驗田位于甘肅省慶陽市正寧縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園。試驗田地勢平坦，土壤類型為黃綿土，基礎肥力中等，位于N35°41'，E108°37'，海拔為1360 m，屬于溫帶大陸性半濕潤氣候，年平均溫度8～9 ℃，年降水量460～600 mm，年日照時數(shù)2447 h，無霜期180 d左右。

安徽試驗田位于安徽省阜陽市太和縣雙浮鎮(zhèn)水蛭繁殖基地。試驗田地勢平坦，土壤類型為黃潮土，基礎肥力中等，位于N33°15'，E115°36'，海拔為32.5 m，屬于暖溫帶半濕潤季風氣候，年平均溫度14～16 ℃，年降水量約850 mm，年日照時數(shù)2444 h，無霜期220 d左右。

2.2 酚酸和黃酮類成分含量測定

將紫蘇葉樣品粉碎，過四號篩，精密稱取烘干至恒重的樣品粉末0.5 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，加入40%甲醇60 mL，密塞，分2 次進行超聲，共60 min，靜置，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，按參考文獻[7]方法測定。

2.3 揮發(fā)油測定

將紫蘇葉樣品粉碎，過四號篩，精密稱取50 g，用水蒸氣蒸餾法提取，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后用正己烷稀釋1000 倍，定容至5 mL，按參考文獻[5]方法測定。

3 結果

3.1 PA型紫蘇酚酸及黃酮類成分含量變化

3.1.1 含量測定結果 5 份PA 型紫蘇種質(zhì)在3 個栽培地種植后8個成分的含量測定結果見表1。

3.1.2 多元方差分析主體間效應檢驗 將表1 數(shù)據(jù)導入SPSS 19.0進行多因素方差分析，結果見表2。

表1 5份PA型紫蘇種質(zhì)在不同栽培地種植后8個成分及總酚酸、總黃酮的質(zhì)量分數(shù) mg·g-1

根據(jù)表2主體間效應檢驗顯示，不同種質(zhì)中LDG質(zhì)量分數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），不同種植地區(qū)紫蘇中CA、LG、LDG、ADG 和總黃酮質(zhì)量分數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。因此，本研究主要分析上述對含量差異有統(tǒng)計學意義的因素，即分析不同地區(qū)種植對PA型紫蘇葉酚酸和黃酮的影響。

表2 紫蘇種質(zhì)和種植地區(qū)對紫蘇各成分質(zhì)量分數(shù)的主體間效應檢驗

3.1.3 不同地區(qū)紫蘇中含量差異有統(tǒng)計學意義的成分的分布規(guī)律 采用SPSS 19.0 進行進一步的數(shù)學分析，并將含量差異有統(tǒng)計學意義的樣本進行分類，不同成分的地區(qū)差異見表3。

表3 紫蘇中不同成分的地區(qū)差異檢驗（n=5）

根據(jù)數(shù)據(jù)分析可見，所有含量差異有統(tǒng)計學意義的成分在地區(qū)上都分成2 個差異性子集，其中，CA 在北京地區(qū)含量最高，明顯高于其他地區(qū)；LG在甘肅和北京地區(qū)含量最高（甘肅略高于北京），明顯高于安徽地區(qū)；LDG 在甘肅地區(qū)含量最高，高于北京地區(qū)，但是北京地區(qū)從差異性上分析，既可以劃分為甘肅地區(qū)的高含量子集，也可以劃分為安徽地區(qū)的低含量子集；ADG 和總黃酮都是甘肅地區(qū)最高，明顯高于其他地區(qū)。由此分析認為，甘肅地區(qū)對于PA 型種質(zhì)的LG、LDG、ADG 和總黃酮含量有增加的影響，北京地區(qū)對CA、LG 和LDG 含量有增加的影響。

由圖1 可知，甘肅地區(qū)種植的紫蘇LDG、ADG及總黃酮質(zhì)量分數(shù)較高，其次是北京地區(qū)，安徽地區(qū)各成分質(zhì)量分數(shù)較低。

圖1 5份紫蘇種質(zhì)在3個地區(qū)種植CA、LG、LDG、ADG及總黃酮的質(zhì)量分數(shù)

不同種質(zhì)的LDG 和LG、ADG 和總黃酮在不同種植地存在地區(qū)差異，且不同種質(zhì)對環(huán)境的響應存在共性特點，即甘肅地區(qū)含量最高。而與黃酮類成分相比，酚酸類成分的地區(qū)差異不明顯，僅北京地區(qū)種植的種質(zhì)中咖啡酸含量顯著高于其他地區(qū)。

3.2 PA型紫蘇揮發(fā)油變化

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）對所有紫蘇葉揮發(fā)油樣品進行分析，通過NIST 2.0 數(shù)據(jù)庫進行檢索，通過核對文獻資料，共鑒定了32 個化合物以面積歸一化法得到各成分的相對質(zhì)量分數(shù)。由于PA 型紫蘇葉揮發(fā)油的主要成分為紫蘇醛，有少量檸檬烯、石竹烯和法尼烯。PA 型紫蘇的主要成分的分析結果見表4。

根據(jù)表4 可知5 份PA 型紫蘇種質(zhì)異地種植葉揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)差異明顯，甘肅地區(qū)的紫蘇種質(zhì)（ZhJ-z1 除外）揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)均顯著高于其他兩地，平均為0.82%；北京地區(qū)其次，揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)平均為0.58%。安徽地區(qū)的揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)平均最低，僅為0.46%。尤其以AG-12 和BJ-2 在兩地間的差異最明顯，AG-12 在甘肅地區(qū)（0.98%）是安徽（0.34%）的2.88 倍，BJ-2 在甘肅（0.87%）是安徽（0.32%）的2.71倍。

根據(jù)表4 數(shù)據(jù)繪制5 種PA 型紫蘇種質(zhì)異地種植葉揮發(fā)油主要成分差異（圖2），可以看出，各PA型種質(zhì)揮發(fā)油成分異地種植后相對質(zhì)量分數(shù)有所不同，整體來看，甘肅地區(qū)對于紫蘇醛的相對質(zhì)量分數(shù)普遍較高，AG-12 等北方種質(zhì)的紫蘇葉中紫蘇醛相對質(zhì)量分數(shù)在甘肅地區(qū)（75.74%）最高，但是ZhJ-z1的紫蘇醛以安徽（63.52%）最高。安徽地區(qū)的石竹烯和法尼烯相對質(zhì)量分數(shù)普遍高于其他兩地，甚至AG-12 樣本的石竹烯和法尼烯相對質(zhì)量分數(shù)之和已高于紫蘇醛。北京地區(qū)種質(zhì)樣本普遍檢測到檸檬烯，其他地區(qū)相對質(zhì)量分數(shù)較少。安徽地區(qū)紫蘇醇相對質(zhì)量分數(shù)普遍較高，與種質(zhì)并無完全對應關系，AG-12的紫蘇醇相對質(zhì)量分數(shù)最高達到3.09%。

表4 5種PA型紫蘇種質(zhì)異地種植葉揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)及各成分相對質(zhì)量分數(shù) %

圖2 5種PA型紫蘇種質(zhì)異地種植葉揮發(fā)油主要成分差異

整體來講，各PA 型種質(zhì)均為甘肅的揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)最高（ZhJ-z1除外），紫蘇醛相對質(zhì)量分數(shù)最高（除ZhJ-z1 外），其次是北京種植后揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)和紫蘇醛相對質(zhì)量分數(shù)基本居中（僅ZhJ-z1 較低），在安徽種植后紫蘇醛相對質(zhì)量分數(shù)普遍較低（僅ZhJ-z1較高）。初步推測南部地區(qū)種質(zhì)在北方試驗田種植，含量受到較大影響，有待進一步分析討論。

4 討論

本研究認為，酚酸類成分對環(huán)境變化的響應差異無統(tǒng)計學意義，只有CA在北京地區(qū)含量普遍較高；50%以上黃酮類成分差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），LG、LDG、ADG 和總黃酮都在甘肅種植后利于獲得較高含量，而其他黃酮類成分差異并不明顯。

通過揮發(fā)油研究發(fā)現(xiàn)甘肅地區(qū)種植的紫蘇所產(chǎn)紫蘇葉揮發(fā)油品質(zhì)最高，葉揮發(fā)油含量及葉揮發(fā)油中紫蘇醛相對含量均突出高于北京及安徽地區(qū)的結果；北京地區(qū)種植的紫蘇所產(chǎn)紫蘇葉品質(zhì)其次，葉揮發(fā)油含量及葉揮發(fā)油中紫蘇醛相對含量略低于甘肅，而安徽地區(qū)種植的紫蘇所產(chǎn)紫蘇葉品質(zhì)最低，葉揮發(fā)油含量最低，與甘肅地區(qū)相較減少近1/2，紫蘇醛相對含量也最低，法尼烯含量較高。PA 型紫蘇作為藥用，以紫蘇醛為主要成分，可以把紫蘇醛相對含量高的甘肅地區(qū)作為種植葉用紫蘇的優(yōu)勢地區(qū)。除紫蘇醛外，北京地區(qū)種植的紫蘇中檸檬烯含量較其他地區(qū)高，安徽地區(qū)種植的紫蘇中紫蘇醇含量較其他地區(qū)高，同樣值得關注。不同環(huán)境對紫蘇萜類成分合成可能有所影響。

環(huán)境因素影響植物代謝過程中生化途徑和生理過程從而影響揮發(fā)油的生物合成，大多數(shù)情況紫蘇種質(zhì)不會因為環(huán)境的變化導致化學型的改變[6]。本研究的5 份PA 型種質(zhì)的化學型都沒有變化，但不同種植地的成分組成有所變化，AG-12、BJ-2、JS-1、RB-1 的紫蘇醛均在甘肅有最高相對含量，而ZhJ-z1的紫蘇醛在安徽最高，但低于其他4 個種質(zhì)的最高紫蘇醛相對含量，JS-1 同樣是南方種質(zhì)并不存在ZhJ-z1 在揮發(fā)油含量變化上的規(guī)律，并且在酚酸和黃酮方面，南方種質(zhì)的ZhJ-z1 在甘肅地區(qū)依然會含量增加，所以目前的數(shù)據(jù)結果并不能證實種質(zhì)的南北方差異會影響含量。值得關注的是，BJ-2 在北京地區(qū)有較高的檸檬烯，這可能是種植環(huán)境變化而引起單萜合成中關鍵酶的活性或腺毛散發(fā)的單萜種類不同導致[6]。針對化學型相同的PA 型不同種質(zhì)，仍舊存在遺傳的差異，對于環(huán)境變化帶來的次生成分變化還需要更多的研究數(shù)據(jù)來支撐。

綜合5 份PA 型紫蘇種質(zhì)的情況，就本文所涉及的3 塊試驗田而言，甘肅地區(qū)的黃酮含量、紫蘇醛相對含量、揮發(fā)油含量都是最高的，可以作為適宜藥用紫蘇PA 型種質(zhì)的種植地。北京地區(qū)也較為適宜PA型紫蘇種質(zhì)的生產(chǎn)。