當(dāng)歸的形態(tài)變化特征與物質(zhì)積累進(jìn)程△

武偉國，蔡子平，王國祥*，王波

1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中藥材研究所/甘肅省中藥材種質(zhì)改良與質(zhì)量控制工程實驗室/甘肅省名貴中藥材馴化與種苗繁育工程中心，甘肅 蘭州 730070；

2.蘭州海關(guān)技術(shù)中心 食品安全實驗室，甘肅 蘭州 730000

當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 為傘形科（Umbrelliferae）當(dāng)歸屬多年生草本植物，以根入藥，味甘、辛，性溫，含藁本內(nèi)酯、α-蒎烯等不飽和烴、醇、醚、醛、酮、酚、酸、酯、磷脂、多糖和氨基酸等多種成分，具有調(diào)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效，為臨床使用頻率最高的中藥之一[1]。當(dāng)歸在我國地理分布廣泛，具有岷歸、川歸和云歸等多個道地品種，主產(chǎn)區(qū)位于甘肅，約占全國產(chǎn)量的70%[2]。

當(dāng)歸的形態(tài)變化特征與物質(zhì)積累進(jìn)程受遺傳特性、環(huán)境條件和栽培措施等因素的共同影響，而這方面的研究僅有少量文獻(xiàn)報道[3-6]。本研究旨在探討當(dāng)歸形態(tài)特征與藥效成分含量變化、物質(zhì)積累進(jìn)程的關(guān)系，揭示當(dāng)歸產(chǎn)量與品質(zhì)形成機(jī)制，為當(dāng)歸規(guī)范化種植提供參考。

1 材料

1.1 樣品

樣品為2018 年甘肅省定西市岷縣閭井鎮(zhèn)農(nóng)戶所育，經(jīng)冬季窖藏后，于移栽前進(jìn)行挑選，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所龔成文研究員鑒定為當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 種苗。種苗根長（8.00±1.50）cm，根粗（4.50±0.50）mm，根鮮質(zhì)量（0.50±0.10）g。藥材硫基長效配方肥購于甘肅施可豐生態(tài)科技有限公司，N、P2O5和K2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、15%和10%。

1.2 儀器

Secura 224-ICN 型分析天平（德國賽多利斯公司）；SP-756P 型紫外分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）。

1.3 試藥

對照品阿魏酸（批號：D0009741，純度≥99%）、Z-藁本內(nèi)酯（批號：RFS-G01001909023，純度≥98%）均購于上海麥克林生化科技有限公司；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 田間試驗

移栽試驗于2019 年4 月至11 月進(jìn)行，6 次重復(fù)，株行距7.5 cm×40.0 cm，小區(qū)面積11.5 m×4.0 m，種植于道地產(chǎn)區(qū)甘肅省定西市渭源縣會川鎮(zhèn)半陰坡村。各小區(qū)當(dāng)歸的出苗率＞80%，抽薹率＜6%，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義。試驗區(qū)海拔2500 m，氣候高寒陰濕，晝夜溫差大，年平均氣溫4.7 ℃，年平均降水量650 mm，無霜期130 d，土壤類型為黑壚土。試驗地土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)37.1 g·kg-1、速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)215 mg·kg-1、速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)59.6 mg·kg-1、堿解氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)250 mg·kg-1，pH 為7.77，于移栽前基施1200 kg·hm-2藥材硫基長效配方肥。2019 年試驗區(qū)氣溫和10 cm深土壤地溫變化趨勢見圖1。

圖1 2019年當(dāng)歸田間試驗試驗區(qū)氣溫和地溫變化趨勢

2.2 形態(tài)性狀測定

2019 年5 月30 日至11 月10 日，每個小區(qū)每隔20 d 挖取長勢均一的植株30 株，將莖葉與根部分離并清洗泥土后晾干，測定每個植株的葉數(shù)、株高、葉鮮質(zhì)量、根長、根粗和根鮮質(zhì)量形態(tài)性狀并取相應(yīng)的平均值，葉片枯萎變干后不計入莖葉部分，株高以最大葉片葉基至葉片中心的距離為依據(jù)。自然陰干后測定30 株植株混合樣品的葉干質(zhì)量和根干質(zhì)量。

2.3 品質(zhì)性狀的測定

2019 年5 月30 日至11 月10 日，每個小區(qū)每隔20 d 挖取長勢均一的植株30 株，取根部洗滌干凈后帶回實驗室，自然陰干后粉碎（過60 目篩），測定30 株植株混合樣品的浸出物、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3.1 浸出物與揮發(fā)油的測定 參照《中華人民共和國藥典》2020 年版方法，以70%乙醇為溶劑，采用熱浸法測定浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，采用水蒸氣蒸餾法測定揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)[7]。

2.3.2 有機(jī)酸與多糖含量測定 于25 ℃以50%乙醇超聲輔助提取有機(jī)酸，以1 mol·L-1HCl酸化提取液至pH 為2 左右，以正丁醇萃取有機(jī)酸。移取有機(jī)酸提取液5 mL，以酚酞為指示劑，以0.1 mol·L-1NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以溶液由無色變?yōu)榧t色時為滴定終點。以檸檬酸為基準(zhǔn)計算有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。于70 ℃下采用蒸餾水浸提多糖，以Sevage試劑［三氯甲烷-正丁醇（4∶1）］脫蛋白。移取多糖提取液1 mL，依次加入6%苯酚1 mL、蒸餾水1 mL 和濃硫酸5 mL，靜置10 min 后，搖勻，室溫放置30 min，以純水樣品為空白對照，于485 nm 測定吸光度。以葡萄糖為基準(zhǔn)計算多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.066 6X-0.030 0，r=0.999 9，Y表示485 nm 處的吸光度，X（mg·L-1）表示葡萄糖的質(zhì)量濃度。

2.3.3 阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯含量測定 采用高效液相色譜法測定阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯的含量。

2.3.3.1 對照品溶液制備 精密稱取阿魏酸3.75 mg和Z-藁本內(nèi)酯10.00 mg，以含5%甲酸的甲醇溶解后轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中，定容至刻度，則得含75 mg·L-1阿魏酸和200 mg·L-1Z-藁本內(nèi)酯的對照品溶液，使用時按所需倍數(shù)稀釋。

2.3.3.2 供試品溶液制備 取當(dāng)歸粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.3.3 色譜條件 采用Agilent Extend C18色譜柱（250mm×4.6 mm，5μm）；流動相0.1%甲酸甲醇溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，10%～15%A；3～12 min，15%～45%A；12～30 min，45%～65%A；30～35 min，65%～80%A；35～40 min，80%～90%A，40～45 min，90%～10%A）；柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm；流速為0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量為2μL。對照品溶液與供試品溶液的高效液相色譜圖見圖2。

圖2 對照品及當(dāng)歸供試品溶液的高效液相色譜圖

2.3.3.4 檢出限與定量限 分別精密量取對照品溶液適量，以含5%甲酸的甲醇倍比稀釋，按2.3.3.3項下條件測定，以信噪比（S/N）≥3 計算檢出限，以S/N≥10 計算定量限。阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯的檢出限分別為0.015、0.040 mg·L-1、阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯的定量限分別為0.050、0.120 mg·L-1。

2.3.3.5 線性范圍 分別精密量取對照品溶液10、25、50、100、250 μL 并移入50 mL 量瓶中，以含5%甲酸的甲醇定容至刻度。按2.3.3.3 項下條件測定，對峰面積和對照品的質(zhì)量濃度作回歸分析。結(jié)果表明，阿魏酸質(zhì)量濃度在0.015 0～0.375 0 mg·L-1與峰面積線性關(guān)系良好，Z-藁本內(nèi)酯質(zhì)量濃度在0.040 0～1.000 0 mg·L-1與峰面積線性關(guān)系良好。阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=21 255X-116.67（r=0.999 8）；Z-藁本內(nèi)酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=9 800.7X+90.37（r=0.999 3）。

2.3.3.6 精密度試驗 精密量取對照品溶液適量，按2.3.3.3 項下條件連續(xù)測定6 次。阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為2.18%和1.94%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品溶液適量，分別于室溫下放置4、8、12、16、18、24 h，按2.3.3.3項下條件測定。24 h內(nèi)阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為2.65%和2.78%，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.3.8 重復(fù)性試驗 精密稱取當(dāng)歸樣品粉末適量，共6 份，按2.3.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.3.3 項下條件測定。阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為1.86%和2.15%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的當(dāng)歸樣品粉末適量，共6 份，分別加入一定質(zhì)量濃度的對照品溶液適量，按2.3.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.3.3 項下條件測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯的回收率分別為98.93%和96.60%。

表1 當(dāng)歸中阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯的加樣回收率

2.4 數(shù)據(jù)處理

公式（1）中，y0為偏移因子，A為面積因子，w為寬度因子，tc為中心因子；公式（2）中，k為飽和因子（容量因子），a為初始因子，b為速率因子。根據(jù)公式（2）的二階微分方程，可以將積累進(jìn)程劃分為3 個階段，即起始期、指數(shù)期和穩(wěn)定期，以d2y/d2t=0.01kb2對應(yīng)的時間為起始期開始時間，以d2y/d2t=-0.01kb2對應(yīng)的時間為穩(wěn)定期結(jié)束時間，以d3y/d3t=0 對應(yīng)的時間為指數(shù)期開始與結(jié)束時間[8]。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸形態(tài)特征的變化過程

當(dāng)歸葉數(shù)、株高、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量和葉干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化過程見圖3～4。由圖3 可知，當(dāng)歸的葉數(shù)和株高隨時間均呈先遞增后遞減的變化趨勢，這與老葉枯萎新葉新生相關(guān)。葉數(shù)從40 d 的3 片升至120 d 的9 片，再降 至200 d 的2片。株高從40 d 的8.37 cm 升至140 d 的53.87 cm，再降至200 d 的32.48 cm。由圖4 可知，當(dāng)歸的葉鮮質(zhì)量和葉干質(zhì)量隨時間均呈先遞增后遞減的變化趨勢。葉鮮質(zhì)量從40 d的1.39 g升至140 d的165.90 g，再降至200 d 的31.49 g。葉干質(zhì)量從40 d 的0.25 g升至140 d 的25.52 g，再降至200 d 的9.76 g。當(dāng)歸的葉干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間呈先遞減后遞增的變化趨勢，從40 d的17.93%降至140 d的15.38%，再升至200 d的31.09%。

圖3 當(dāng)歸葉數(shù)及株高的變化趨勢（, n=6）

圖4 當(dāng)歸葉質(zhì)量及干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢（, n=6）

當(dāng)歸根長、根粗、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量和根干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化過程見圖5～6。由圖5 可知，當(dāng)歸的根長和根粗隨時間均呈遞增的變化趨勢。根長從40 d的9.11 cm 升至200 d 的35.41 cm。根粗從40 d 的4.93 mm 升至200 d 的32.09 mm。由圖6 可知，當(dāng)歸的根鮮質(zhì)量和根干質(zhì)量隨時間均呈遞增的變化趨勢。根鮮質(zhì)量從40 d 的0.68 g 升至200 d 的124.29 g。根干質(zhì)量從40 d 的0.14 g 升至180 d 的38.30 g，再略微降至200 d 的38.01 g。當(dāng)歸的根干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時間呈先遞減后遞增再遞減的變化趨勢，從40 d的20.12%降至60 d的19.51%，再升至160 d的34.78%，再降至200 d 的30.54%。

圖5 當(dāng)歸根長及根粗的變化趨勢（, n=6）

圖6 當(dāng)歸根質(zhì)量及干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢（, n=6）

當(dāng)歸莖葉與根部的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例的變化過程見圖7。由圖7可知，當(dāng)歸的根葉鮮質(zhì)量比、干質(zhì)量比隨時間呈先遞減后遞增的變化趨勢。根葉鮮質(zhì)量比從40 d 的0.49 降至80 d 的0.18，再升至200 d 的4.05。根葉干質(zhì)量比從40 d的0.55 降至60 d 的0.21，再升至200 d 的3.96。當(dāng)歸的根葉干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比隨時間呈先遞增后遞減的變化趨勢，從40 d 的1.13 升至140 d 的1.88，再降至200 d的0.98。

圖7 當(dāng)歸根葉鮮質(zhì)量比、干質(zhì)量比和干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)比的變化趨勢（, n=6）

3.2 當(dāng)歸藥效成分的變化過程

當(dāng)歸浸出物、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯含量的變化過程見表2。

浸出物和揮發(fā)油是控制芳香類中草藥質(zhì)量的重要指標(biāo)[9]。由表2 可知，當(dāng)歸的浸出物含量隨時間呈先遞增后遞減再遞增的變化趨勢。浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)從40 d的40.33%升至200 d的58.83%。當(dāng)歸的揮發(fā)油含量隨時間呈先遞增后遞減的變化趨勢。揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)從40 d的0.49%升至180 d的1.66%，再降至200 d的1.26%。

表2 當(dāng)歸浸出物、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（, n=6） %

表2 當(dāng)歸浸出物、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（, n=6） %

注：同列不同小寫字母表示P＜0.05。

當(dāng)歸總有機(jī)酸主要包括丁二酸、壬二酸、癸二酸、茴香酸、肉蔻豆酸、樟腦酸、阿魏酸、煙酸、香草酸、正二十四酸、棕櫚酸等，具有很強(qiáng)的抗氧化活性和抗菌活性[10]。多糖作為一類生物大分子，具有廣泛的生物學(xué)活性。當(dāng)歸多糖由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等成分組成，對機(jī)體免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)等有明顯作用，在抗腫瘤、抗放射性損傷上有良好療效[11-12]。由表1 可知，當(dāng)歸的有機(jī)酸含量和多糖含量均隨時間呈遞增的變化趨勢。有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)從40 d 的6.47%升至200 d 的11.39%。多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)從40 d的17.25%升至200 d的19.26%。

阿魏酸是當(dāng)歸有機(jī)酸的代表成分，Z-藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸中具有重要生理活性的成分[13]，其常被作為當(dāng)歸的藥效標(biāo)志物。由表1 可知，當(dāng)歸的阿魏酸含量和Z-藁本內(nèi)酯含量均隨時間呈遞增的變化趨勢。阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)從40 d 的0.050% 升至200 d 的0.081%。Z-藁本內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)從40 d 的0.31%升至200 d的1.13%。

3.3 當(dāng)歸物質(zhì)積累進(jìn)程的非線性擬合

莖葉生物量y（g）隨時間t（d）呈先增大后減小的趨勢，以高斯方程為模型進(jìn)行擬合。根部生物量、浸出物、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯y（g）等隨時間t（d）均呈增大的趨勢，以邏輯斯蒂方程為模型進(jìn)行擬合。

擬合方程及統(tǒng)計分析見表3。由表3 可見，對于莖葉生物量，R2＞0.950 0，χ2（5）＜χ20.01（5）=15.09（P＜0.01），F(xiàn)（4,5）＞F0.01（4,5）=11.39（P＜0.01）；對于根部生物量、浸出物、揮發(fā)油、阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯，R2＞0.950 0，χ2（6）＜χ20.01（6）=16.81（P＞0.01），F(xiàn)（3,6）＞F0.01（3,6）=9.78（P＜0.01），因此，擬合精度和擬合優(yōu)度均很好。

表3 當(dāng)歸生物量及藥效成分積累進(jìn)程的擬合方程及統(tǒng)計分析（n=9）

時間分界及各時期的特征見表4。由表4 可知，浸出物、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯的積累進(jìn)程的3 個階段與根部生物量有很高的重疊性。

表4 當(dāng)歸生物量及藥效成分積累進(jìn)程的時期劃分及各時期的特征

4 結(jié)論與討論

4.1 當(dāng)歸成藥期生長發(fā)育期的劃分

根據(jù)當(dāng)歸莖葉及根部的生長狀況，當(dāng)歸成藥期生長過程可初步劃分為5 個階段：出苗期（0～20 d，移栽至5 月中旬）、莖葉緩慢生長期（20～60 d，5 月中旬至6月中旬）、莖葉旺盛生長期（60～120 d，6月中旬至8月中旬）、根部旺盛生長期（120～160 d，8月中旬至9 月中旬）和根部穩(wěn)定生長期（160～200 d，9 月中旬至11月中旬）。

4.2 當(dāng)歸成藥期物質(zhì)積累規(guī)律

生物量的積累與分配過程從表象上反映了植物的生長發(fā)育過程。0～20 d 期間，根部提供營養(yǎng)以供基芽生長，生物量有所消耗。20～60 d，莖葉及根部生物量的積累速度均較慢，這一階段主要發(fā)生不定根及側(cè)根的構(gòu)建過程；60～120 d，莖葉生物量的積累速度較快，而根部生物量的積累速度較慢，這一階段莖葉的快速生長為光合作用創(chuàng)造條件。120～200 d，莖葉及根部生物量的積累發(fā)生2 次質(zhì)變。在120 d 左右，根部生物量的積累速度超過莖葉生物量，這時氣溫開始＜20 ℃。在150 d 左右，根部生物量超過莖葉生物量，實現(xiàn)了生物量主要分配區(qū)從莖葉到根部的過渡，這時氣溫開始＜15 ℃。特別是在140 d左右，莖葉生物量的積累進(jìn)入衰退期，這與老葉開始枯萎有關(guān)，在160 d左右，根部生物量的積累進(jìn)入穩(wěn)定期。

浸出物、揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖、阿魏酸和Z-藁本內(nèi)酯的積累是當(dāng)歸次生代謝過程的主要表現(xiàn)，在整個觀測期，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增加了18.50%、0.76%、2.02%、4.93%、0.03%和0.82%，且積累進(jìn)程的3 個階段與根部生物量的重疊性很高，即其積累從屬于根部生物量。