經典名方真武湯的物質基準關鍵質量屬性△

尚炳嫻，趙振霞，董慧玲，張佟，蘇建，劉永利*，徐冰*，雷海民

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102400；

2.河北省藥品檢驗研究院，河北 石家莊 050200

真武湯首見于漢代張仲景所著的《傷寒論》[1]，由茯苓、白芍、生姜、白術和附子5 味中藥組成，具有溫陽利水的功效?，F代臨床上真武湯主要用于治療慢性腎炎、腎病綜合征、尿毒癥及腎積水等陽虛水飲內停證，真武湯系統疾病[2-5]。該方作為治療太陽病及少陰病的經典名方，被《古代經典名方目錄（第一批）》（以下簡稱《目錄》）[6]收載。

經典名方物質基準是指以古代醫籍中記載的經典名方制備方法為依據制備的中藥藥用物質的標準，除成型工藝外，其余制備方法應當與古代醫籍記載基本一致[7]。經典名方物質基準既是保證經典名方現代制劑與中醫傳統臨床所用藥物一致的參照物，又是現代制劑工藝篩選及標準制訂的依據和準繩[8-11]。物質基準在經典名方研發過程中起到承上啟下的作用，是鏈接中醫臨床傳統用藥形式和現代成品復方制劑的橋梁，是保證臨床療效不降低、產品質量穩定一致的核心環節[12-15]。

《古代經典名方中藥復方制劑及其物質基準的申報資料要求（征求意見稿）》（以下簡稱《意見稿》）[7]指出，應開展藥材、飲片、標準煎液及物質基準的質量研究，確定關鍵質量屬性，實現全過程質量控制，通過物質基準凍干粉出粉率、含量測定、指紋圖譜或特征圖譜等，確保標準煎液及物質基準的批間質量基本一致及可追溯。本研究采用隨機數表法將真武湯5味飲片隨機組合成15批真武湯組方，并相應地制備15 批真武湯物質基準凍干粉，采用高效液相色譜法（HPLC）建立真武湯特征圖譜和指標性成分含量測定方法，分析飲片與物質基準間的指標成分量值傳遞規律，初步制定真武湯物質基準的質量標準，實現對真武湯物質基準的質量控制，為經典名方真武湯及其相關制劑的研發及生產提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo 公司）；1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Pilot5-8M 型冷凍干燥機（北京博醫康技術有限責任公司)；KQ5200DA 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；4L 陶瓷鍋（潮州市一壺百飲電器實業有限公司）；H22-X1 型電陶爐（九陽股份有限公司）。

1.2 試藥

對照品芍藥苷（批號：110736-202044，純度：96.8%）、6-姜辣素（批號：111833-202007，純度：99.3%）、沒食子酸（批號：110831-200302，純度：91.5%）、8-姜酚（批號：111993-201601，純度：93.8%）、(+)-兒茶素（批號：877-200001，純度：95.1%）、5-羥甲基糠醛（批號：111626-201912，純度：99.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；對照品苯甲酰芍藥苷（批號：O11GB163260，純度≥98%）購于上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為實驗室自制超純水。

真武湯所需藥材購自安國聚藥堂有限公司，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定，符合《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版規定，由北京春風藥業有限公司按前期研究確定的炮制方法炮制加工成各批次飲片，并按《中國藥典》2020年版規定檢測，均符合規定。

根據隨機數表法將真武湯中的5 味飲片進行隨機組合及排序，組成15批真武湯組方物質基準（表1）。

表1 15批真武湯物質基準飲片信息

2 方法與結果

2.1 15批真武湯物質基準的制備

分別稱取茯苓41.4 g、白芍41.4 g、生姜41.4 g、白術27.6 g、炮附子10.0 g，加水1600 mL，浸泡30 min，閉蓋，武火（1500 W）煎煮至沸騰，開蓋，轉文火（600 W）煎煮保持微沸，約60 min，趁熱以雙層200目濾布濾過并榨干藥渣，放冷，定容至600 mL，預凍，真空冷凍干燥（＜-40 ℃，＜20 Pa）72 h，即得。

2.2 真武湯物質基準特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 WatersC18色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，3%A；7～16 min，3%～10%A；16～31 min，10%～13%A；31～37 min，13%～20%A；37～62 min，20%～32%A；62～81 min，32%～46%A；81～86 min，46%～65%A；86～98 min，65%A）；檢測波長為230 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為20 μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取真武湯物質基準凍干粉0.1 g，精密加入50%甲醇25 mL，超聲處理30 min，6000 r·min-1離心5 min（離心半徑為8.4 cm），用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品芍藥苷、6-姜辣素、沒食子酸4.978、5.092、10.072 mg，分別加甲醇定容至10 mL；分別精密稱取對照品苯甲酰芍藥苷、8-姜酚、(+)-兒茶素、5-羥甲基糠醛5.261、170.920、5.208、6.571 mg，分別加甲醇定容至25 mL制成相應的對照品儲備液。

分別精密吸取8-姜酚對照品儲備液1 mL，芍藥苷、6-姜辣素、沒食子酸對照品儲備液各2 mL，苯甲酰芍藥苷、(+)-兒茶素、5-羥甲基糠醛對照品儲備液各5 mL，混勻后定容至25 mL，制成混合對照品溶液。

2.2.4 單味藥供試品溶液的制備 分別取處方用量的茯苓、白芍、生姜、白術、炮附子飲片，按2.1項下方法制備單味藥物質基準凍干粉；并按2.2.2項下方法制備單味藥供試品溶液。

2.2.5 方法學考察 精密度：取同一供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進行HPLC分析，連續進樣6次，記錄色譜圖。以5 號峰（芍藥苷）為參照峰，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積及其RSD，結果見表2。

表2 真武湯特征圖譜方法學考察 %

穩定性：取同一供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進行HPLC 分析，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，記錄色譜圖。以5 號峰（芍藥苷）為參照峰，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積及其RSD，結果見表2。

重復性：分別精密稱取同一批次物質基準粉末0.05、0.10、0.15 g 各3 份，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，并按2.2.1 項下色譜條件依次進行HPLC 分析，記錄色譜圖。以5號峰（芍藥苷）為參照峰，計算各峰的相對保留時間和相對峰面積及其RSD，結果見表2。

2.2.6 15 批真武湯物質基準的特征圖譜相似度評價 按2.2.1 項下特征圖譜色譜條件分別稱取15 批真武湯物質基準0.1 g，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，并進行HPLC 測定，得到15 批真武湯特征圖譜。將15 批真武湯物質基準特征圖譜依次導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），以S1 為參照圖譜，采用中位數法，時間窗寬度為0.1，進行多點校正和色譜峰匹配，生成對照圖譜并計算相似度，15 批真武湯物質基準的相似度均大于0.99。確定了11 個特征峰，15 批真武湯物質基準特征圖譜疊加圖見圖1。

圖1 15批真武湯物質基準特征圖譜

2.2.7 真武湯物質基準的特征圖譜共有峰的指認及歸屬 將真武湯特征圖譜與混合對照品溶液及單味藥供試品溶液進行對照，指認出其中7個色譜峰，分別為沒食子酸（1號峰）、5-羥甲基糠醛（2號峰）、(+)-兒茶素（3號峰）、芍藥苷（5號峰）、苯甲酰芍藥苷（9號峰）、6-姜辣素（10號峰）、8-姜酚（11號峰），見圖2。其中1號峰、3號峰、5號峰、9號峰來自白芍；2號峰來自炮附子；10號峰、11號峰來自生姜。綜合15批真武湯物質基準相對保留時間結果（表3），確定了真武湯物質基準特征圖譜鑒別標準，供試品特征圖譜中共有11個特征峰，以5號峰芍藥苷為參照峰（S峰），計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間偏差應在規定值的±10%之內。規定值為0.274（峰1）、0.331（峰2）、0.695（峰3）、0.908（峰4）、1.164（峰6）、1.208（峰7）、1.240（峰8）、1.707（峰9）、2.190（峰10）、2.452（峰11）。

表3 15批真武湯物質基準特征峰相對保留時間

圖2 真武湯物質基準供試品溶液及對照品溶液特征圖譜

2.3 含量測定方法的建立

2.3.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm,5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，15%～17%A；5～15 min，17%～19%A；15～25 min，19%～55%A；25～28 min，55%～62%A；28～40 min，62%～90%A）；檢測波長為230 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min-1；進樣量為20 μL。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取真武湯物質基準凍干粉0.1 g，加入50%甲醇25 mL，超聲處理30 min，6000 r·min-1離心5 min（離心半徑為8.4 cm），用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.3 對照品溶液的制備 分別取對照品芍藥苷、6-姜辣素5.772、3.281 mg，分別加甲醇定容至10 mL，制成對照品儲備液。

分別精密吸取上述2 個對照品儲備液4 mL，混合，用甲醇定容至25 mL，分別制成質量濃度為0.089 4、0.052 1 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.4 方法學考察 專屬性：按2.1 項下方法分別制備不含白芍和生姜的陰性物質基準凍干粉，并按2.3.2 項下方法分別制備缺白芍、缺生姜的陰性樣品溶液；取混合對照品、供試品及陰性樣品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進行HPLC 分析，記錄色譜圖，結果見圖3。

圖3 白芍、生姜專屬性考察HPLC圖

線性關系：分別取芍藥苷和6-姜辣素對照品儲備液適量，1∶1 混合配制成混合對照品溶液，分別稀釋至1、2、4、8、16、32 倍，按2.3.1 項下色譜條件進行HPLC 分析，考察峰面積與質量濃度的線性關系，結果見表4。

精密度：取同一供試品溶液進行HPLC 分析，按2.3.1 項下色譜條件連續進樣6 次，分別測定芍藥苷和6-姜辣素的峰面積，計算RSD，結果見表4。

穩定性：取同一供試品溶液進行HPLC分析，按2.3.1項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測定芍藥苷和6-姜辣素的峰面積，計算RSD，結果見表4。

重復性：分別精密稱取同一批真武湯物質基準粉末0.05、0.10、0.15 g各3份，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，并按2.3.1 項下色譜條件進行HPLC 分析，測定芍藥苷和6-姜辣素的含量，計算RSD，結果見表4。

加樣回收率試驗：精密稱取與重復性同一批次物質基準粉末0.05 g 9份，分別按已知芍藥苷和6-姜辣素含量的1.0∶0.5、1∶1、1.0∶1.5 精密稱取芍藥苷和6-姜辣素對照品，按2.3.3項下方法制備對照品溶液；以對照品溶液為提取溶劑，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，每個質量濃度平行3 份；并按2.3.1項下色譜條件依次進行HPLC 分析，測定芍藥苷和6-姜辣素的含量，計算其加樣回收率，結果見表4。

表4 芍藥苷和6-姜辣素含量測定方法學考察 %

2.3.5 15 批真武湯物質基準的量值傳遞分析 取15 批真武湯物質基準凍干粉，按2.3.2 項下方法分別制備15 批真武湯供試品溶液，每批平行2 份；按2.3.1項下色譜條件依次進行HPLC 分析，計算芍藥苷和6-姜辣素的含量，并計算飲片到物質基準的量值傳遞，結果見表5。

根據上述含量測定結果可知，15 批真武湯出粉率為3.21%～4.57%；15 批物質基準中芍藥苷質量分數為20.01～25.35 mg·g-1，飲片-物質基準轉移率為49.77%～61.84%；6-姜辣素質量分數為1.65～2.57 mg·g-1，飲片-物質基準轉移率為30.11%～58.96%。參照《意見稿》規定，指標性成分含量范圍一般不超過均值的70%～130%[7]，根據表5 可知，15 批真武湯物質基準中芍藥苷和6-姜辣素含量穩定在均值的70%～130%。

表5 15批真武湯出粉率及物質基準中指標成分量值傳遞

3 討論

3.1 物質基準制備方法的考察

本研究采用加10 倍量水閉蓋武火煎煮至沸騰，開蓋轉文火煎煮保持微沸至煎煮終點的方式制備真武湯物質基準水煎液，所得濾液經過冷凍干燥得到凍干粉，作為物質基準對應實物。在煎煮過程中分別以微沸30、45、60、75 min 為煎煮終點，第3 份煎煮完后（微沸60 min）的藥渣再加8 倍量水煎煮40 min，得到二次煎液；共制得5份不同煎煮時間的煎液。以所得水煎液體積為主要依據，對煎煮時間進行考察。結果表明，以微沸45 min 為煎煮終點所得煎液體積與真武湯原文記載最為接近。

3.2 供試品溶液制備方法的考察

本研究考察25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇3種提取溶劑，結果顯示，50%甲醇提取的真武湯供試品溶液中各指標成分含量最高；分別考察0.05、0.10、0.15 g 3 種凍干粉取樣量，結果顯示，在0.05～0.15 g 指標成分含量與取樣量成正比；考察20、25、50 mL 3 種提取溶劑用量，結果顯示，25 mL 提取溶劑提取的真武湯供試品溶液中各指標成分含量最高；考察回流提?。?50 ℃）、超聲提?。?00 W，40 kHz）2 種提取方式，結果顯示，2 種方式提取后的真武湯供試品溶液中各指標成分相差不大，且超聲提取的樣品重復性更好；考察20、30、40 min 3 種提取時間，結果顯示，提取30 min的真武湯供試品溶液中各指標成分含量最高。故選擇取樣量為0.10 g，以25 mL 50%甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min制備供試品溶液。

4 結論

本研究使用不同批次飲片制備15批真武湯物質基準，建立了真武湯HPLC特征圖譜，共確定了11個特征峰，指認出沒食子酸、5-羥甲基糠醛、(+)-兒茶素、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、6-姜辣素、8-姜酚7個色譜峰，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2008 版）進行相似度分析，相似度均大于0.99；以芍藥苷、6-姜辣素為指標性成分建立真武湯中多成分HPLC 含量測定方法，以不超過質量均值的70%～130%為界限設定各含量指標的量值范圍，結果表明，15 批真武湯物質基準的特征圖譜物質基準中芍藥苷質量分數為20.01～25.35 mg·g-1，6-姜辣素質量分數為1.65～2.57 mg·g-1。