經典名方清上蠲痛湯的煎煮工藝對其指標成分轉移率的影響△

王慧敏，祝倩倩，翟燕娟，王協和，袁健，陸兔林，張科衛*，李松*

1.南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京 210023；

2.江陰天江藥業有限公司，江蘇 江陰 214400

清上蠲痛湯載于《壽世保元》[1]，明代著名醫家龔廷賢之名方，“清上”指清上部的熱，“蠲痛”意為祛除疼痛。清上蠲痛湯具有祛風散寒、清熱除濕、活血止頭痛的功效，其辛而不燥、溫而不熱、苦而不寒、泄而不降，既可升散風邪，又能苦泄濁陰，適用于各種頭痛之證[2]。黃芩中的黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素等黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、解熱鎮痛及治療心血管疾病等作用[3-4]。蔓荊子所含的蔓荊子黃素等黃酮類成分具有止痛、抗菌、消炎作用，對心血管疾病、腫瘤等也顯示出一定的療效[5]。防風中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷等色原酮類化合物具有鎮痛和解熱作用[6]。甘草中的甘草酸、甘草次酸具有促腎上腺皮質激素的作用，可用于解毒、抗炎、鎮咳、抗菌等[7]。

目前，關于清上蠲痛湯的研究多集中于臨床應用，僅有1 篇清上蠲痛湯指紋圖譜的研究報道[8]，尚未見到有關其凍干粉、工藝方面的文獻報道。本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）建立清上蠲痛湯物質基準（以下簡稱凍干粉）中黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸、蔓荊子黃素和升麻素苷的含量測定方法，計算了各指標成分的轉移率，根據出膏率、主要指標成分含量及轉移率關鍵指標對清上蠲痛湯凍干粉的煎煮工藝和銼散粒度進行研究，可為其他煮散劑凍干粉煎煮工藝和銼散粒度的研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity 型超高效液相色譜儀、Empower 3 工作站（Waters 公司）；kQ-250E 型超聲清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；ME204E 型電子天平、XP6 型百萬分之一天平（Mettler-Toledo 公司）；Milli-Q?IQ 7005型純水系統（Millipore公司）；TGL-16C型離心機（上海安亭科學儀器廠）；YMW 2L 500W 型陶瓷保健壺（深圳市一枚王電子商務有限公司）、DFY-200C 型搖擺式高速粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司，200 g）；171E（SCRC）型恒溫磁力攪拌器（國藥集團化學試劑有限公司）；TRL-0.5 型真空凍干機（大連雙瑞科技有限公司）。

1.2 試藥

對照品黃芩苷（批號：110715-201821，純度：95.4%）、漢黃芩苷（批號：112002-201702，純度：98.5%）、蔓荊子黃素（批號：111554-201705，純度：98.3%）、甘草酸銨（批號：110731-202021，純度：96.2%）、升麻素苷（批號：111522-201712，純度：96.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、甲酸、磷酸均為色譜純；其他試劑均為分析純。藥材及飲片經江陰藥業有限公司唐波工程師鑒定均為正品，樣品信息見表1。

表1 清上蠲痛湯處方樣品信息

2 方法

2.1 檢測樣品制備

2.1.1 凍干粉對應實物制備 取日處方藥量：酒當歸3.73 g、川芎3.73 g、白芷3.73 g、細辛1.12 g、羌活3.73 g、獨活3.73 g、防風3.73 g、菊花1.87 g、蔓荊子1.87 g、麩炒蒼術3.73 g、酒黃芩5.60 g、麥冬3.73 g、甘草1.12 g，粉碎，加水406 mL（9倍量），浸泡30 min，煮沸后再煎煮20 min，200 目篩趁熱濾過，殘渣加水316 mL（7倍量），煮沸后再煎煮15 min，200 目篩趁熱濾過，合并2 次濾液，即得清上蠲痛湯水煎液。放冷后，精密移取清上蠲痛湯水煎液4 mL 至西林瓶中，冷凍干燥72 h，得到清上蠲痛湯凍干粉對應實物樣品。

2.1.2 供試品溶液制備 取凍干粉約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液1。

取凍干粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液2。

2.1.3 對照品溶液制備 取對照品黃芩苷、漢黃芩苷適量，精密稱定，加甲醇制成黃芩苷、漢黃芩苷質量濃度分別為1500、350 μg·mL-1的溶液，即得對照品溶液1。

取對照品甘草酸銨、蔓荊子黃素適量，精密稱定，加50%甲醇制成甘草酸銨、蔓荊子黃素質量濃度分別為97、10 μg·mL-1的溶液，即得對照品溶液2。

取對照品升麻素苷適量，精密稱定，加50%甲醇制成升麻素苷質量濃度為35 μg·mL-1的溶液，即得對照品溶液3。

2.2 有效成分的UPLC定量檢測

2.2.1 黃芩苷和漢黃芩苷 取2.1.2 項下制備的供試品溶液1 和2.1.3 項下制備的供試品溶液1，以甲醇-0.2%磷酸溶液（48∶52）為流動相，檢測波長為355 nm的色譜條件進行方法學考察。

2.2.2 蔓荊子黃素和甘草酸 取2.1.2 項下制備的供試品溶液2 和2.1.3 項下制備的供試品溶液2，以流動相為甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～10 min，57%A；10～15 min，57%～75%A；15～16 min，75%～90%A；16～18 min，90%A），檢測波長為254 nm的色譜條件進行方法學考察。

2.2.3 升麻素苷 取2.1.2 項下制備的供試品溶液2 和2.1.3 項下制備的對照品溶液3，以甲醇-乙腈-0.05%甲酸溶液（15∶8∶77）為流動相，檢測波長為254 nm的色譜條件進行方法學考察。

2.3 出膏率及有效成分轉移率的影響因素考察

2.3.1 提取時間 《壽世保元》中未對本方的加水量、煎煮時間進行明確要求，煎煮方式為水煎服[1]。根據2020 年在北京舉行的首屆經典名方開發專家共識峰會上的指導意見、國家中醫藥管理局發布的《按古代經典名方目錄管理的中藥復方制劑藥學研究技術指導原則（征求意見稿）》[9]及張星等[10]研究表明，基準樣品應根據國家發布的古代經典名方關鍵信息及古籍記載內容進行制備，若國家發布的古代經典名方關鍵信息或古籍記載內容中僅為“水煎服”等，對于此類無詳細工藝制法表述的方劑，應參照《醫療機構中藥煎藥室管理規范》[11]并結合具體情況，合理確定制備工藝。

綜合以上結果，清上蠲痛湯按照《醫療機構中藥煎藥室管理規范》煎煮要求[11]，取日處方量飲片粉碎，一煎加水406 mL（9 倍量），二煎加水316 mL（7 倍量）浸泡30 min。含芳香揮發性有效成分的藥物煎煮時間則不宜過長，以避免芳香成分喪失，損失藥性，降低藥效[12]。因方中防風、羌活、白芷、細辛等為解表類中藥，而解表類中藥的煎煮時間一般規定在20 min左右[13]。故本研究以一煎20 min為基點，考察4種不同的煎煮時間。煎煮后濾液均趁熱過200目篩，合并一煎、二煎2次濾液。分別考察一煎30 min、二煎25 min；一煎25 min、二煎20 min；一煎20 min、二煎15 min；一煎15 min、二煎10 min，4種不同煎煮時間的凍干粉的出膏率，黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸、蔓荊子黃素和升麻素苷指標成分的轉移率。

2.3.2 提取過程加蓋與否 本研究在處方量飲片煎煮時，考察了煎煮過程中加蓋和不加蓋條件下對清上蠲痛湯出膏率和有效成分轉移率的影響。按照處方劑量，稱取清上蠲痛湯日處方劑量，將每劑復方分別置于各藥煎壺中，一種方式全程加蓋，另一種方式全程不加蓋，加水406 mL浸泡30 min，煮沸后再煎煮20 min，濾液趁熱過200 目篩，殘渣加水316 mL 煮沸后再煎煮15 min，趁熱過200目篩，合并2次濾液，即得清上蠲痛湯的加蓋和不加蓋的水煎液。分別考察凍干粉的出膏率，黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸、蔓荊子黃素和升麻素苷指標成分的轉移率。

2.3.3 粒度 飲片制備成粗顆粒不僅可以節省飲片、增大飲片與溶劑的接觸面積，還可減少煎煮時間、增加有效成分的溶出[14]。但有時粒度過細并不一定利于有效成分的煎出。使用銅舂和粉碎機對飲片進行銼散處理，得到不同粒徑大小的飲片顆粒。按日劑處方量分別稱取13 味飲片銼碎，依次過4 目篩、10 目篩和24 目篩，得到3 種不同粒度的顆粒，按2.1.1 項下方法制得凍干粉。分別考察其凍干粉的出膏率，黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸、蔓荊子黃素和升麻素苷等指標成分的轉移率。

3 結果與討論

3.1 指標成分的UPLC圖譜

清上蠲痛湯中黃芩苷、漢黃芩苷、蔓荊子黃素、甘草酸和升麻素苷的含量色譜圖見圖1～3。

圖1 清上蠲痛湯及黃芩苷、漢黃芩苷色譜圖

3.2 UPLC色譜條件

3.2.1 黃芩苷、漢黃芩苷 安捷倫ZORBAX Eclispse Plus C18RRHD（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以甲醇-0.2%磷酸溶液（48∶52）為流動相；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為355 nm；進樣體積為1 μL。

圖2 清上蠲痛湯及蔓荊子黃素、甘草酸色譜圖

圖3 清上蠲痛湯及升麻素苷色譜圖

3.2.2 蔓荊子黃素、甘草酸 安捷倫ZORBAX Eclispse Plus C18RRHD（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，57%A；10～15 min，57%～75%A；15～16 min，75%～90%A；16～18 min，90%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm；進樣體積1 μL。

3.2.3 升麻素苷 安捷倫ZORBAX BONUS RP RRHD（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以甲醇-乙腈-0.05%甲酸溶液（15∶8∶77）為流動相；流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm；進樣體積1 μL。

3.3 UPLC方法學驗證

方法學考察結果顯示，清上蠲痛湯中5個指標成分的含量測定方法儀器精密度、線性、重復性、穩定性均良好，加樣回收率均在規定范圍內，結果見表2。

3.4 有效成分的轉移率及其影響因素

3.4.1 提取時間 測定4 種煎煮時間下清上蠲痛湯中黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸、蔓荊子黃素和升麻素苷的轉移率及凍干粉的出膏率（表3）。按公式（1）計算轉移率。

表3 不同煎煮時間清上蠲痛湯中5個主要指標成分的轉移率及出膏率 %

由表2 可知，不同的煎煮時間黃芩苷轉移率幾乎沒有差異，表明煎煮時間對黃芩苷的轉移率沒有較大影響；煎煮時間越長漢黃芩苷的轉移率越高；隨著煎煮時間縮短，甘草酸和蔓荊子黃素的轉移率略有升高；一煎25 min，二煎20 min 升麻素苷的轉移率最高。結果表明不同煎煮時間條件下出膏率差別不大。綜合以上的結果，最終選擇一煎20 min，二煎15 min作為煎煮時間。

表2 清上蠲痛湯中5個指標成分含量測定方法學考察

煎煮時間過久，防風有效成分含量降低，可能是因為煎煮時間對中藥某些成分的含量具有一定的影響，在煮藥的過程中，隨著煎煮時間的不同，單味藥的各組分之間也可能產生復雜的化學反應，這些反應最終影響中藥中某些成分的含量[12]。煎煮中藥的過程是中藥有效成分不斷向溶液釋放、溶解的過程，當藥液中有效成分溶解到一定質量濃度后，溶解和析出過程達到平衡，就不會再釋放有效成分，再繼續煎，不僅不會使藥物內的有效成分繼續溶解，反而會使藥液中的有效成分不斷蒸發而減少，甚至使有效成分在長時間的高溫中遭到破壞，導致藥效降低[15-16]。復方中有效成分含量復雜，一個時間點不能保證所有藥物的有效成分均被煎出且不被破壞[17]。綜合考慮整個復方藥味的特點及指標成分的轉移率等因素，確定最佳煎煮時間。

3.4.2 提取過程加蓋與否 測定加蓋和不加蓋條件下煎煮出的清上蠲痛湯中黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸、蔓荊子黃素和升麻素苷的轉移率及凍干粉的出膏率，結果見表4。

表4 加蓋與否清上蠲痛湯中主要指標成分的轉移率及出膏率 %

由表4 可知，加蓋煎煮時各指標成分的轉移率均高于不加蓋，因為方中所含的蔓荊子黃素和升麻素苷含量較低，所以對蔓荊子黃素和升麻素苷的轉移率影響較大。黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸因含量較高，含量較穩定，所以轉移率的增長幅度不大，在5%左右。蔓荊子黃素轉移率增長幅度為40%，升麻素苷轉移率增長幅度為16%。增長幅度較大，推測蔓荊子黃素和升麻素苷在不加蓋煎煮時，可能加大了與空氣中的氧氣反應，轉化成具有揮發性的物質，或者與其他物質發生反應，一部分轉化為其他物質。加蓋煎煮時的平均出膏率略高于不加蓋煎煮。

如果煎中藥不加蓋，中藥內的有效成分便易隨水蒸氣“跑”出去，降低藥物療效。有些藥物的有效成分為揮發油，大多揮發油比水輕，開蓋煎煮，揮發油隨水蒸氣一起蒸出[14]。綜合以上結果，此方需加蓋煎煮。

3.4.3 粒度 不同粒度煎煮，清上蠲痛湯中指標成分的轉移率及出膏率結果見表5。

表5 不同銼散粒度清上蠲痛湯中主要指標成分的轉移率及出膏率 %

結果顯示，黃芩苷和漢黃芩苷的轉移率在飲片粒度過24目篩時明顯低于其他2種銼散粒度；飲片過24目煎煮時的甘草酸和蔓荊子黃素的轉移率明顯偏高；銼散粒度對升麻素苷的轉移率未有明顯影響。24目的出膏率也微高于其他2種粒度。隨著飲片粒徑的減小，甘草顆粒的比表面積增大，吸附作用增強，被吸附的甘草酸分子增多；而擴散作用也會增強，甘草酸分子溶出的也越多[7]。當粒度減小，由于擴散作用不起主導作用，表面能的作用加強，黃芩苷分子越容易吸附在黃芩顆粒表面，較難溶解出來，黃芩苷的溶出量也就越低[18]。

甘草日劑量為1.12 g，在全方中占比僅為2.48%，比較清上蠲痛湯水煎液中甘草對應固形物含量，飲片過4 目篩0.090%，過10 目篩0.092%，過24 目篩0.117%，3 種銼散粒度對于湯劑中甘草對應固形物含量的影響不是很大。甘草緩急止痛、調和諸藥[19]，為本方中使藥。蔓荊子日劑量為1.87 g，在全方中占比為4.14%，比較清上蠲痛湯水煎液中蔓荊子對應固形物質量分數，飲片過4 目篩和10 目均為0.011%，24 目為0.113%，3 種銼散粒度對于湯劑中蔓荊子對應固形物含量幾乎沒有影響。比較濾過后的不同銼散粒度的水煎液，飲片過4 目篩時水煎液清澈，另2 種水煎液渾濁，且24 目篩煎出液在濾過時極為困難。

雖然飲片經過粉碎可提高某些有效成分的溶出，但也可能會增加其他一些未知成分的溶出。清上蠲痛湯13 味藥中有8 味藥是質地堅硬或纖維性強的根及根莖類藥材，這類藥材不易粉碎，若要進行煮散，粉碎粒度會受限，為方便操作，有必要在保證質量的前提下適當放大粉碎粒度[20]。同時考慮到生產的可行性，最終確定飲片的銼散粒度為全部過4 目篩，但混有通過10目篩的不超過20%。

4 討論與結論

研究結果表明，不同的煎煮時間對各成分的煎出率具有較為明顯的影響。在確定本方煎煮時間時，不僅要考慮到某些成分的轉移率，還要考慮方中較多藥味為清熱類和芳香類中藥，不宜久煎。在煎煮過程中進行加蓋，從而降低有效成分隨水蒸氣的蒸發而減少的影響，以保證藥物療效。本研究前期通過查閱文獻、論壇討論等多種途徑，選擇將飲片粉碎成過4 目篩、10 目篩和24 目篩。結果表明除升麻素苷外，不同的銼散粒度對其他指標成分的轉移率有較為明顯的影響，隨著飲片粉碎粒度的減小，煎出率提高，出膏率隨之增大。經典名方的最終研究歸于制劑生產，考慮到后續大生產的煎煮設備，避免造成煎煮時設備堵塞等不必要的影響，選擇粉碎粒度較高的過4 目篩作為銼散粒度。因方中大多數中藥中含有揮發油，在后期小試實驗中能否收集到揮發油還需進一步實驗研究。

在實驗過程中，取樣不均等各方面因素對各指標成分的轉移率均有影響，在后期實驗中，對于飲片的選擇應盡量保持統一的規格，減少因取樣帶來的誤差；盡量保持藥煎壺功率一致，降低因實驗儀器帶來的誤差。

本研究從指標成分含量和出膏率等多方面考察，對凍干粉的煎煮時間、加蓋與否和銼散粒度等工藝參數進行研究和確定。本研究僅為實驗室實驗，后期的工業化生產還需參考本研究的參數進行小試、中試等研究。對于凍干粉后續開發研究，還需全面考察藥材-飲片-中間體-對應實物的相關性，并對對應實物制備過程中關鍵質量屬性的量值傳遞關系進行深入研究。