地骨皮藥材飲片和標準湯劑的定量檢測及UPLC特征圖譜的建立

史紫娟，曾杉，林碧珊，高永堅，劉勇，梁思韻，區淑蘊

國藥集團 廣東環球制藥有限公司，廣東 佛山 528305

地骨皮為茄科植物枸杞Lycium chinenseMill.或寧夏枸杞L.barbarumL.的干燥根皮，具有涼血除蒸、清肺降火之功效，用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、肺熱咳嗽等癥[1]。地骨皮含有生物堿、黃酮、蒽醌及有機酸等多種化學成分，其中生物堿類主要有地骨皮甲素和地骨皮乙素等[2-3]。地骨皮甲素和地骨皮乙素屬于酚酰胺類，是地骨皮中的特有成分，也是其主要的藥效成分。現代藥理學研究表明，地骨皮具有降血壓、調血脂、降血糖、抑菌抗炎、免疫調節、解熱鎮痛等作用[4-5]。本研究參考《香港中藥材標準》中地骨皮的質量標準[6]，以地骨皮乙素為定量指標，采用超高效液相色譜法（UPLC）測定地骨皮藥材、飲片和標準湯劑中地骨皮乙素的含量，對地骨皮藥材進行質量控制。

中藥飲片標準湯劑作為中藥配方顆粒臨床療效的標準參照物，在《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》等文件中明確要求有關中藥配方顆粒的所有研究均應與標準湯劑進行對比研究[7-9]。因此，本研究建立地骨皮藥材-飲片-標準湯劑的UPLC特征圖譜及有效成分的定量檢測方法，深入開展藥材-飲片-標準湯劑的相關性分析，為地骨皮的質量控制及中藥配方顆粒和經典名方的研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-Class型UPLC儀（美國Waters公司）；XPR105 DR 型天平、AL104 型天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；KQ5200DA型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FTS-40F 型陶瓷保健壺（潮州市一壺百飲電器實業有限公司）；TRL-0.5 型真空冷凍干燥機（大連雙瑞科技有限公司）；Synergy UV 型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

對照品地骨皮甲素（批號：DST170724-101，純度≥96%）、地骨皮乙素（批號：DST170724-105，純度≥98%）均購自成都德思特生物技術有限公司；甲醇和乙腈（美國BCR 公司，色譜純）；甲酸、磷酸、三氟乙酸（Aladdin 公司，色譜純）；水為超純水。

18 批地骨皮藥材分別產自陜西、河南、山西、寧夏等地，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為茄科植物枸杞Lycium chinenseMill.的干燥根皮，按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版標準檢驗全部合格，并參考其地骨皮項下炮制方法制成地骨皮飲片[1]。具體炮制方法：除去泥沙、異物及殘留木心等雜質，噴淋10 s，于烘箱60 ℃干燥2 h。藥材產地分別為陜西省渭南市（S1～S3）、河南省洛陽市（S4～S6）、山西省運城市（S7～S12）、寧夏固原市（S13～S15）、寧夏銀川市（S16～S18）。

2 方法與結果

2.1 地骨皮標準湯劑的制備

取地骨皮飲片100 g，加水煎煮2 次，一煎加10 倍量水浸泡30 min，加熱25 min，用350 目篩趁熱濾過；二煎藥渣再加8 倍量水，加熱20 min，趁熱濾過，合并2 次濾液。減壓濃縮至150 g 左右的浸膏，即得地骨皮標準湯劑。浸膏加水稀釋至含固率約15%，再進行冷凍干燥，即得地骨皮標準湯劑凍干粉。

2.2 UPLC特征圖譜

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗 Waters BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為甲醇（A）-0.15%三氟乙酸水溶液（B），洗脫梯度（0～5 min，8%～14%A；5～14 min，14%～25%A；14～23 min，25%～50%A；23～26 min，50%～90%A）；檢測波長為280 nm；柱溫為40 ℃；流速為0.25mL·min-1，進樣量為1μL。理論板數按地骨皮乙素峰計算應不低于10 000。

2.2.3 藥材和飲片供試品溶液的制備 取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加入甲醇-0.5%乙酸溶液（1∶1）的混合溶液適量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，放冷，用甲醇-0.5%乙酸溶液（1∶1）的混合溶液定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 標準湯劑供試品溶液的制備 取本品凍干粉約0.1 g，精密稱定，與2.2.3 項下“置25 mL 量瓶中”后相同操作，取續濾液，即得。

2.2.5 方法學考察 精密度試驗：取地骨皮標準湯劑供試品溶液，連續進樣6 次，結果各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于2%，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取地骨皮標準湯劑凍干粉，平行制備6 份供試品溶液進樣測定，結果各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明該方法重復性良好。

穩定性試驗：取地骨皮標準湯劑供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，結果各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.2.6 樣品測定 按2.2.3 和2.2.4 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件分別對18 批地骨皮藥材、飲片和標準湯劑進行測定，記錄色譜圖，見圖1～3。

圖1 18批地骨皮藥材UPLC特征圖譜

圖2 18批地骨皮飲片UPLC特征圖譜

圖3 18批地骨皮標準湯劑UPLC特征圖譜

2.2.7 共有峰的標定 將各批地骨皮藥材、飲片及標準湯劑所得結果分別導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012版），設參照圖譜、對色譜圖進行多點校正、峰匹配，采用平均數法生成多批樣品的特征圖譜與對照特征圖譜。選擇分離度較好、峰面積穩定的色譜峰作為共有峰，最終藥材、飲片和標準湯劑分別各確定了5個共有峰，見圖1～3。通過對照品指認了2 個特征峰，其中2 號峰為地骨皮乙素、3 號峰為地骨皮甲素，見圖4。地骨皮藥材、飲片與標準湯劑對照特征圖譜見圖5。以峰2（地骨皮乙素）為參照峰，分別計算地骨皮藥材、飲片和標準湯劑中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表1。結果表明，不同產地的藥材物質群接近，炮制不會對物質群造成太大改變。

表1 地骨皮藥材、飲片、標準湯劑UPLC特征圖譜分析（, n=18）

表1 地骨皮藥材、飲片、標準湯劑UPLC特征圖譜分析（, n=18）

圖4 地骨皮乙素、地骨皮甲素對照品溶液的UPLC圖

圖5 地骨皮藥材、飲片與標準湯劑對照特征圖譜

2.2.8 相關性分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版），對各批供試品特征圖譜與對照圖譜進行比較，分別計算18 批地骨皮藥材、飲片、標準湯劑的相似度，結果見表2。18 批地骨皮藥材與對照特征圖譜的相似度為0.951～0.994，飲片相似度為0.942～0.991，標準湯劑相似度為0.978～0.999。說明不同來源的地骨皮藥材和飲片主成分具有較好的一致性。所標定5 個共有特征峰經多批次產品驗證，各峰均可在標準湯劑、藥材和飲片特征圖譜中得到追蹤，表明地骨皮從藥材到標準湯劑過程中各成分得到了有效的轉移。

從各元素的沸點可知，由鐵到砷揮發率越來越大，所以控制適當的真空度和溫度，鉛、鉍、砷、銻能以氣態揮發出來，而鐵、銅則留在錫液中。

表2 18批地骨皮藥材、飲片、標準湯劑的相似度

2.3 地骨皮藥材、飲片和標準湯劑中有效成分的定量測定

《中國藥典》2020 年版地骨皮藥材及飲片均沒有相應的含量測定項，本研究參考《香港中藥材標準》中地骨皮的含量測定項方法[6]，采用UPLC 同時建立了地骨皮藥材、飲片和標準湯劑中地骨皮乙素的含量測定方法，可為制定地骨皮配方顆粒的質量控制標準提供參考。

2.3.1 色譜條件與系統適用性試驗 同2.2.1項下方法。

2.3.2 對照品溶液的制備 取地骨皮乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇-0.5%乙酸溶液（1∶1）的混合水溶液制成質量濃度為120 μg·mL-1的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 地骨皮藥材和飲片供試品溶液的制備同2.2.3 項下方法，標準湯劑供試品溶液的制備同2.2.4項下方法。

2.3.4 方法學考察

2.3.4.1 線性關系考察 精密稱取地骨皮乙素對照品20.03 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇-0.5%乙酸溶液（1∶1）的混合水溶液溶解并定容至刻度，作為對照品儲備溶液。分別精密量取上述儲備液稀釋成質量濃度分別為25.04、50.08、100.15、200.30、400.60、801.20 μg·mL-1的對照溶液，按2.3.1項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰面積。以地骨皮乙素的峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程：Y=1 480.247X+4 499.614（r=1.000），表明25.04～801.20 μg·mL-1時，地骨皮乙素質量濃度與峰面積線性關系良好。

2.3.4.2 精密度試驗 取地骨皮乙素對照品溶液，按2.3.1項下色譜條件連續進樣6次，計算地骨皮乙素峰面積的RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 穩定性試驗 取地骨皮標準湯劑約0.1 g，精密稱定，按2.3.3 項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、16、20、24 h進樣，計算地骨皮乙素峰面積的RSD 為0.4%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4.4 重復性試驗 取地骨皮標準湯劑約0.1 g，精密稱定，按2.3.3項下方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件測定，測定供試品溶液中地骨皮乙素含量并計算RSD為0.9%，表明該方法重復性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗 取同一批已知含量的地骨皮標準湯劑約50 mg，平行稱取6 份，精密稱定，置25 mL 具塞錐形瓶中，分別按1∶1 加入地骨皮乙素對照溶液，按2.3.3 項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件測定，結果地骨皮乙素的平均回收率為101.6%，RSD 為0.8%。

2.3.5 地骨皮標準湯劑出膏率測定 將18 批地骨皮飲片按2.1 項下方法制備成標準湯劑，測定樣品的出膏率，按公式（1）計算出膏率。

2.3.6 地骨皮藥材、飲片和標準湯劑樣品測定根據已建立的含量測定方法對18 批地骨皮藥材、飲片及標準湯劑進行定量測定并計算飲片到標準湯劑的轉移率，結果見表3。結果表明18 批地骨皮標準湯劑出膏率為10.22%～14.34%，均值為12.89%，地骨皮乙素的轉移率為33.63%～56.82%，均值為44.84%；按照均值的70%～130%計算地骨皮乙素的轉移率為31.39%～58.29%，18 批地骨皮標準湯劑的轉移率均在此范圍內，未出現離散數據。

表3 地骨皮藥材、飲片及標準湯劑測定結果 %

3 討論

本研究參考《香港中藥材標準》中地骨皮藥材的特征圖譜方法[6]，對檢測波長、流動相、色譜柱、柱溫、流速等系統適應性條件進行優化，通過全波長掃描確定280 nm 下色譜圖基線平穩、分離度較好，色譜峰信息更多且響應值較高，故選擇280 nm 作為特征圖譜的檢測波長。考察了不同體系流動相甲醇-0.15%三氟乙酸水溶液、乙腈-0.15%三氟乙酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液對特征圖譜的影響，結合分離度和峰形選擇甲醇-0.15%三氟乙酸水溶液作為流動相體系。比較了3種不同類型色譜柱Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）、WatersCSH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）的分離效果，最終選擇Waters BEH C18色譜柱。考慮到柱溫和流速會影響分離度，所以考察了20、30、40 ℃的柱溫，確認40 ℃柱溫時分離度最佳。考察了0.20、0.25、0.30 mL·min-1的流速，結果流速為0.25 mL·min-1時，各特征峰的分離度及峰形更優。

本研究考察了不同溶劑［甲醇、50%甲醇、甲醇-0.5%乙酸溶液（1∶1）的混合水溶液、水］、提取方法（回流、超聲）、提取時間（20、30、40 min）對地骨皮標準湯劑特征圖譜提取效果的影響，結果顯示，用甲醇-0.5%乙酸溶液（1∶1）的混合水溶液超聲提取30 min 時提取效果最好，特征峰的數量和響應值最優。

4 結論

本研究制備的18 批地骨皮標準湯劑的出膏率為10.22%～14.34%，平均出膏率為12.89%。測定標準湯劑中地骨皮乙素的質量分數為7.47%～14.35%，平均質量分數為10.95%；地骨皮乙素從飲片到標準湯劑的轉移率為33.63%～56.82%，平均轉移率為44.84%。本研究利用UPLC 特征圖譜、出膏率、含量測定及轉移率，對地骨皮藥材、飲片和標準湯劑進行了質量傳遞性研究，是經典名方及中藥配方顆粒所倡導的研究方法，具有良好的科學性和合理性[10]。18 批地骨皮藥材、飲片和標準湯劑的特征圖譜通過擬合共確定了5 個特征峰，通過對照品指認了地骨皮甲素和地骨皮乙素，將多批結果導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）進行計算，結果18 批地骨皮藥材、飲片和標準湯劑的相似度均大于0.90，說明三者特征圖譜具有良好的相關性。地骨皮標準湯劑特征圖譜與地骨皮藥材和飲片特征圖譜化學成分基本一致，能夠準確地反映藥材-飲片-標準湯劑之間化學成分的可追溯性。通過標準化工藝得到的地骨皮標準湯劑質量穩定，建立的特征圖譜方法和指標性成分的定量檢測方法可同時用于地骨皮藥材、飲片和標準湯劑的分析測定，研究結果可為地骨皮配方顆粒的質量標準研究及后期經典名方的研究提供參考。