大豆苷元干預Hedgehog信號通路調控去卵巢骨質大鼠基質金屬蛋白酶代謝

白登彥 王冠 張海軍 朱濤 趙志鵬

1.甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730015 2.西北民族大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730015

骨質疏松(osteoporosis，OP)主要表現為骨微結構改變及骨強度降低，其發病機制與雌激素降低等多種因素有關。研究發現[1-2]，基質金屬蛋白酶代謝對成骨細胞的分化、增殖及代謝起關鍵作用，其中基質金屬蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-3，MMP-7)和基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)的含量變化與OP發病存在密切關系[3-4]。大豆苷元是大豆異黃酮的主要成分之一，與17β-雌二醇的結構相似，研究指出[5]，大豆苷元能夠干預破骨細胞的形成，調控骨質疏松過程，但機制不明確。研究發現[6]，刺猬(Hedgehog，Hh)信號通路與雌激素通路有相互促進作用，而且能干預成骨細胞，調控骨細胞生長和增殖。本研究通過大豆苷元濃縮液灌胃干預OP模型大鼠，探究大豆苷元對Hedgehog信號通路的調控作用，并分析其對基質金屬蛋白酶代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SPF級20周齡Wistar大鼠60只(購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK(甘)2020-0001)，體質量(200±20)g，飼養于甘肅中醫藥大學SPF動物中心，適應性自由進食、飲水，1周后進行OP實驗造模。

1.2 藥物、試劑及儀器

大豆苷元(北京藥品生物制品檢定所，純度>98%，批號：20001)，血清雌激素(E2)、骨鈣素(BGP)、血清堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(上海信帆生物，批號：E202009P、E202041P、E202033P)。PBS緩沖液(北京藍博斯特)，瓊脂糖(濟南匯錦川)，TRIZOL試劑(北京萊博潤科)，兔多克隆抗體PTC1、Gli1、Shh(美國Sigma，批號：47014、43022、42150)；羊抗兔二抗(美國Thermo，批號：QE225340)；SDS-PAGE試劑盒(批號：45420)、PCR試劑盒(批號：45525)、BCA檢測試劑盒(批號：48751)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號：76330)、ECL試劑盒(批號：98417)均購自美國CST公司，奧林巴斯光學顯微鏡(JAPAN)；PCR熱循環儀及熒光定量PCR儀(美國伯樂)。

1.3 動物分組、造模及處理

將60只大鼠按隨機數字法分為假手術組、模型組、大豆苷元治療低、中、高劑量組共5組，每組12只。除假手術組外，其他組大鼠按照參考文獻[7]，腹腔麻醉后，沿腹中線劍突下切口，分離中下腹部肌肉，打開腹膜，暴露大鼠腹腔，切除雙側卵巢后制備OP模型。術后控制飲食，自由飲水。造模成功后開始灌胃治療，假手術組及模型組給予等劑量生理鹽水灌胃，大豆苷元低、中、高劑量組大鼠分別按人鼠比例2.42、4.84、9.68 mg/(kg·d)灌胃治療，1次/d，共持續12周。灌胃結束24 h后，大鼠股動脈取血5 mL，迅速離心并提取上清液保存。處死大鼠后取股骨組織樣品4份保存備用。

1.4 指標處理及檢測

1.4.1ELISA檢測：取上清液，參照ELISA試劑操作說明，檢測各組大鼠血清中血清E2、BGP、ALP含量水平變化。

1.4.2免疫組化檢測：取各組大鼠股骨組織進行石蠟包埋切片，脫蠟后水洗進行抗原修復后室溫孵育過夜，PBS洗滌3次，室溫孵育60 min，滴加一抗二抗后，PBS洗滌3次，DAB在顯微鏡下染色，高倍鏡下(×400)觀察各組標本中MMP-7及TIMP-1陽性染色情況，并進行半定量分析。

1.4.3TUNEL法檢測：取各組大鼠股骨組織，常規方法石蠟切片后二甲苯洗滌2次，每次5 min，梯度乙醇浸洗后PBS漂洗細胞通透液處理，加入含過氧化氫的PBS漂洗后加入TUNEL反應混合液于標本上檢測標本中各組大鼠骨組織細胞凋亡情況，顯微鏡下記錄并拍照。

1.4.4RT-PCR法檢測：RNA抽提試劑盒提取各組大鼠骨組織中總RNA，反轉錄獲取各組cDNA后設計引物序列，參考RT-PCR實驗方法對各組Shh、PTC1、Gli1 mRNA表達量進行檢測，內參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，采用 2-ΔΔCt方法分析不同組別mRNA表達量。引物序列見表1。

表1 PCR擴增引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.4.5Western blot檢測：各組股骨組織中加入RIPA裂解緩沖液提取樣本中的總蛋白，參照BCA檢測說明測定各組股骨組織中蛋白的含量。SDS-PAGE將蛋白質等量分離，4 ℃條件下PDVF膜上添加一抗孵育過夜。PBS洗滌后常溫下添加二抗2 h孵育。ECL試劑顯影后應用軟件Quantity One測定PTC1、Gli1、Shh蛋白表達水平。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 血清E2、BGP、ALP水平變化

與假手術組大鼠對比，模型組大鼠的BGP、ALP升高，E2含量降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組對比，大豆苷元治療組BGP、ALP含量降低，E2含量升高(P<0.05)，且大豆苷元隨劑量增加治療效果更加明顯(P<0.01)。見表2。

表2 不同組大鼠血清E2、BGP、ALP含量對比

2.2 股骨組織中MMP-7及TIMP-1蛋白含量變化

免疫組化染色結果顯示，模型組大鼠組織中MMP-7及TIMP-1表達明顯增多；干預治療后，各治療組MMP-7及TIMP-1表達明顯減少，其中大豆苷元隨劑量增加治療效果更加明顯(P<0.01)。見圖1，表3。

圖1 大鼠骨組織中MMP-7及TIMP-1含量對比(×400)Fig.1 Comparison between MMP-7 and TIMP-1 contents in bone tissue of rats(×400) 注：A：假手術組，B：模型組，C：大豆苷元低劑量組，D：大豆苷元中劑量組，E：大豆苷元高劑量組。

表3 大鼠骨組織中MMP-7及TIMP-1含量對比

2.3 股骨組織細胞凋亡情況比較

藍色熒光為正常細胞核，綠色熒光為凋亡細胞。鏡下顯示，假手術組大鼠骨組織正常，綠色熒光極少；模型組大鼠造模后綠色熒光增多，提示凋亡細胞增加；干預治療后，各治療組大鼠股骨遠端細胞凋亡數量減少，其中大豆苷元隨劑量增加治療效果更加明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠股骨遠端細胞凋亡情況(×200)Fig.2 Apoptosis of the distal femur cells in each group(×200)

2.4 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh mRNA表達水平

與假手術組對比，模型組大鼠股骨組織中PTC1、Gli1、Shh mRNA表達升高(P<0.05)。與模型組對比，各治療組PTC1、Gli1、Shh mRNA含量明顯降低(P<0.05)，且大豆苷元的治療效果隨劑量增加更加明顯(P<0.01)。見圖3。

圖3 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh mRNA表達量比較Fig.3 Comparison among PTC1, Gli1, and Shh mRNA expression in the femur注：A：假手術組，B：模型組，C：大豆苷元低劑量組，D：大豆苷元中劑量組，E：大豆苷元高劑量組。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

2.5 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh蛋白表達水平

與假手術組對比，模型組股骨組織中PTC1、Gli1、Shh蛋白表達升高(P<0.05)。與模型組對比，各治療組PTC1、Gli1、Shh蛋白含量表達降低(P<0.05)，且大豆苷元的治療效果隨劑量增加更加明顯(P<0.01)。見圖4。

圖4 股骨組織中PTC1、Gli1、Shh蛋白表達對比Fig.4 Comparison among PTC1, Gli1, and Shh protein expression in the femur注：A：假手術組，B：模型組，C：大豆苷元低劑量組，D：大豆苷元中劑量組，E：大豆苷元高劑量組。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05。

3 討論

雌激素替代治療是雌激素缺乏導致的OP的主要治療方法，但其禁忌癥較多[8]。植物激素存在與雌激素相似的功能和結構，其中部分植物激素在組織中能夠選擇性地與雌激素受體(ER)結合，發揮弱雌激素樣活性作用。大豆苷元是一種具有類似雌激素功能的非甾類化合物。研究顯示[9-10]，大豆苷元能夠有效抗雌激素活性，改善骨損傷，干預成骨細胞的形成，但其具體機制不詳。

血清E2濃度是反映絕經后機體雌激素水平最重要的一種激素[11]。BGP和ALP由成骨細胞分泌產生，其表達水平能夠體現骨形成與骨吸收的過程，是評估骨質量的關鍵指標[12]。本研究結果顯示，在摘除大鼠卵巢后，大鼠E2含量明顯降低，BGP、ALP含量升高，證明大鼠在造模后雌激素降低，骨質量發生改變，經過大豆苷元干預后，OP大鼠E2明顯升高，BGP、ALP含量明顯降低，說明OP大鼠在大豆苷元干預后，雌激素水平及骨的發育得到一定改善。MMP-7是骨吸收過程中具有降解細胞外基質作用的酶，在OP發病過程中MMP-7過表達可降解細胞外蛋白多糖、IX型膠原等多種基質蛋白產物，影響骨組織平衡狀態下基質的合成與分解，加速骨吸收過程[13]。TIMPs作為金屬蛋白酶抑制因子，對組織中的間質膠原酶以及間質溶解素具有特異性，可直接與活化的MMPs家族形成1∶1復合體進而抑制MMPs活性，降低MMP-7對骨組織的損害[14]。本研究顯示，OP大鼠的骨組織在造模后MMP-7及TIMP-1蛋白含量發生明顯變化，MMP-7表達增高，TIMP-1表達降低，經大豆苷元干預治療后，MMP-7及TIMP-1蛋白含量發生明顯改善，這說明大豆苷元干預了骨組織中MMP-7及TIMP-1的蛋白表達。

Hh信號通路是骨細胞分化過程中的關鍵通路之一，與骨細胞形成及骨代謝疾病存在密切關系[15]。在骨細胞分化過程中，Hh信號通路的關鍵受體音猬因子(Shh)與下游基因12次跨膜蛋白Ptched1(Ptch1)和膠質瘤相關腫瘤基因同源物 1(Gli-1)在成骨細胞中表達，進而促進骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞和軟骨細胞[16-17]。骨缺損和骨再生過程中Shh含量變化可激發骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，這是促進骨組織生成的關鍵因素[18]。正常骨組織中Hh信號活性較低，當激發骨細胞分化時，Hh通路中關鍵的因子含量發生明顯變化，其中關鍵因子Gli1能夠調控膜型金屬基質蛋白酶(MTI-MMP)的表達來促進細胞的遷移和侵襲，而Shh表達變化與MMP-7及TIMP-1存在密切聯系[19-20]。本研究也表明，OP大鼠造模成功后，骨組織細胞凋亡明顯增加，基質金屬蛋白酶發生改變，PTC1、Gli1、Shh蛋白及基因表達也發生明顯改變，這說明Hh信號通路參與了OP的發病過程。而且本實驗還證實，大豆苷元干預OP大鼠后，大鼠骨細胞凋亡情況顯著改善，而骨組織中Hh信號通路相關蛋白基因及基質金屬蛋白酶也發生明顯改善，這也證明大豆苷元有效調控了OP大鼠Hh信號通路的表達，影響細胞凋亡過程，干預了基質金屬蛋白酶代謝，進而影響OP的發病過程。

綜上所述，大豆苷元可調控Hh信號通路，影響基質金屬蛋白酶代謝，干預骨細胞凋亡過程，但其干預的具體機制仍需深入研究。