miR-155靶向調節PIK3R1對類風濕關節炎大鼠模型PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

吳燾 張國秋 李超 張蘭濤

青海大學附屬醫院關節外科，青海 西寧 810012

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性關節炎性疾病，病理特征以關節組織炎癥損傷、軟骨組織破損、滑膜增生等為主，患者關節畸形、疼痛、功能受損，導致其行動不便，工作能力喪失，生活質量嚴重下降[1-2]。RA患者免疫系統功能紊亂，體內氧化應激水平增高，抑制炎癥，可減輕足腫脹、水腫等關節炎癥狀，是防治RA的有效手段[3]。miR-155可抑制TLR4/NF-κB信號激活，抑制炎癥，明顯改善大鼠臨床癥狀[4]。PI3K/Akt信號可參與介導RA的發生發展過程，阻斷其傳導，可減少促炎因子產生，阻止炎癥反應，抑制滑膜增生，改善RA大鼠關節炎癥狀[5]，PIK3R1是PI3K/Akt/mTOR信號的負調節因子，脂多糖可下調其表達，促使炎癥進展[6-7]，miR-155可靶向下調PIK3R1的表達，進而激活PI3K/Akt信號，促進軟骨細胞凋亡[8]，但miR-155靶向調節PIK3R1對RA大鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路及關節炎癥的影響目前還不清楚，本文通過構建RA大鼠模型，對此進行探究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級SD雄性大鼠，成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號為SCXK(川)2020-030，動物飼養和實驗操作均嚴格遵循《實驗動物管理條例》要求。

1.1.2主要試劑與儀器：牛Ⅱ型膠原(貨號1220-02)由艾美捷科技有限公司提供；不完全弗氏佐劑(貨號7002)由北京博蕾德生物科技有限公司提供；人胚腎細胞株293 T(CL-0005)、DMEM培養基(PM150210)分別由武漢普諾賽生命科技有限公司和北京索萊寶科技有限公司提供；胎牛血清(30044333)、Opti-MEM培養基(31985062)由美國Thermo Fisher Scientific公司提供；LipofectamineTM2000(11668019)由美國invitrogen公司提供；miR-155 agomir、miR-155 antagomir、miR-155陰性對照、PIK3R1 3′-UTR無義序列、野生型PIK3R1 3′-UTR報告質粒、突變型PIK3R1 3′-UTR報告質粒，由吉凱基因公司提供；miR-155、U6、GAPDH、PIK3R1引物由上海生工生物工程股份有限公司提供；高效RIPA裂解液(貨號R0010)、總RNA提取試劑盒(貨號R1200)、HE染色試劑盒(貨號G1120)、逆轉錄試劑盒(貨號T2240)、大鼠IL-6 ELISA試劑盒(貨號SEKR-0005)、大鼠IL-17 ELISA試劑盒(貨號SEKR-0007)、大鼠IL-18 ELISA試劑盒(貨號SEKR-0054)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號PC0020)、SYBR Green Realtime PCR Master Mix(貨號QPK-201)、胰蛋白酶-EDTA消化液(T1300)、青鏈霉素混合液(P1400)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號D0010)由北京索萊寶科技有限公司提供；兔源Anti-PI3K一抗(貨號ab151549)、兔源Anti-GAPDH(貨號ab181602)一抗、兔源Anti-p-PI3K一抗(貨號ab138364)、兔源Anti-AKT一抗(貨號ab179463)、兔源Anti-p-AKT一抗(貨號ab38449)、兔源Anti-p-mTOR一抗(貨號ab84400)、兔源Anti-mTOR一抗(貨號ab2732)、羊抗兔二抗(貨號ab150077)由Abcam公司提供等。

YLS-7B足趾容積測量儀由上海鑫閔生命科技有限公司提供(中國)；CX23光學顯微鏡由Olympus公司提供(日本)；XElx800型酶標儀由Perkin Elmer公司提供(美國)；ABI 7500實時PCR系統由應用生物系統公司提供(美國)；RM2035輪轉切片機由萊卡公司提供(德國)；Mini PROTEAN蛋白電泳儀與轉膜儀由伯樂公司提供(美國)；GIS-500型凝膠成像儀由杭州米歐儀器有限公司提供(中國)等。

1.2 方法

1.2.1建立RA大鼠模型及分組處理：參照文獻[9]誘導建立RA模型大鼠：將牛Ⅱ型膠原蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混合，勻漿攪拌(30 000 r/min，2.5 min)，制成乳劑，于大鼠尾部皮下注射200 μL，1周后再次注射200 μL，3 d后即完成造模，造模成功率87.3%，死亡7只，將其隨機分為模型組、miR-155 agomir組、miR-155 antagomir組、miR-155陰性對照組，每組均12只，另取12只大鼠以同樣方法注射等劑量0.9% NaCL溶液，作為對照組。

參照文獻[10]及說明書，將miR-155 agomir、miR-155 antagomir、miR-155陰性對照溶于0.9% NaCL溶液，以100 μg/g的劑量分組尾靜脈注射，模型組、對照組大鼠尾靜脈注射等劑量0.9% NaCL溶液，隔日注射一次，共注射3次。

1.2.2大鼠關節炎指數評分及后足趾容積測定：給藥干預結束后24 h，觀察大鼠雙側后足關節癥狀進行評分，標準如下[11]：關節無腫脹，形態正常，0分；關節輕微腫脹，1分；關節中度腫脹，2分；關節嚴重腫脹，3分；關節嚴重腫脹并出現運動障礙，4分。然后以足趾容積測量儀測量大鼠后足趾容積，每只大鼠測量3次，取平均值。

1.2.3大鼠關節組織病理形態檢測及標本采集：以乙醚氣體麻醉大鼠，然后頸椎脫臼處死，解剖取出雙側后足關節，每只大鼠剪下兩塊關節組織，均約0.8 g，分組標記后保存在液氮中。剩余關節組織漂洗、脫水、透明、包埋后切片，然后選出厚薄均勻且無破損的關節組織切片，脫蠟、水化、HE染色(步驟參照試劑盒說明書)、漂洗、脫水、透明、封片，使用顯微鏡觀察大鼠關節組織病理形態，并選出任意5個視野進行拍照。

1.2.4大鼠關節組織炎性因子IL-6、IL-17及IL-18水平檢測：取出1.2.3中保存在液氮中的關節組織0.8 g，研碎后，加入高效RIPA裂解液，冰水浴中勻漿，4 ℃離心后取出上清，通過BCA法測出各組蛋白總濃度后檢測IL-6、IL-17及IL-18水平(步驟參照各自試劑盒說明書)，剩余關節組織蛋白樣品液保存在-80 ℃，進行蛋白表達檢測。

1.2.5大鼠關節組織PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達水平測定：取1.2.4中剩余的各組關節組織蛋白樣品液，加入適量上樣緩沖液后煮沸，5 min后蛋白變性后向SDS-PAGE濃縮膠上樣孔中加入含20 μg總蛋白的樣品液，電泳(110 V，85 min)將蛋白在分離膠中充分分離，濕轉(40 mA，75 min)將分離膠中蛋白轉移至硝酸纖維膜上，蛋白非特異位點經5%的脫脂奶粉封閉(37.5 ℃，2 h)后，根據分子量截下目的蛋白，經兔源Anti-PI3K一抗、Anti-GAPDH一抗、Anti-p-PI3K一抗、Anti-AKT一抗、Anti-p-AKT一抗、Anti-p-mTOR一抗、Anti-mTOR一抗孵育12 h(4 ℃)，洗膜3次(TBST，37.5 ℃，5 min/次)，羊抗兔二抗孵育1.5 h(37.5 ℃)，洗膜3次(TBST，37.5 ℃，5 min/次)，化學發光法顯色，采集蛋白條帶圖像，運用Image J軟件對其灰度值定量，然后統計做分析后得出各組蛋白相對表達量。

1.2.6大鼠關節組織miR-155及PIK3R1 mRNA水平檢測：將1.2.3中保存在液氮中的關節組織0.8 g研碎后，提取總RNA后通過逆轉錄實驗制得cDNA(步驟參照各自試劑盒說明書)，取反應排管，向其中依次加入6 μL DEPC水，10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix，0.4 μL ROX染料，上、下游引物各0.8 μL，混勻后上機做PCR擴增，參照試劑說明指導設定反應參數，所得Ct值采用2-ΔΔCt法計算，以U6做miR-155內參，以GAPDH做PIK3R1內參，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-155對PIK3R1的靶向調控：將購買的293 T細胞快速解凍后，以5 mL細胞培養液(DMEM培養基+1%青鏈霉素混合液+10%胎牛血清)重懸混勻，接種在培養瓶中，無菌培養至細胞基本鋪滿瓶底，傳代后接種在24孔板，無菌培養12 h后隨機分為轉染PIK3R1 3′-UTR無義序列+miR-155 mimics陰性對照組、轉染PIK3R1 3′-UTR無義序列+miR-155 mimics組、轉染野生型PIK3R1 3′-UTR報告質粒+miR-155 mimics陰性對照組、轉染野生型PIK3R1 3′-UTR報告質粒+miR-155 mimics組、轉染突變型PIK3R1 3′-UTR報告質粒+miR-155 mimics陰性對照組、轉染突變型PIK3R1 3′-UTR報告質粒+miR-155 mimics組，將細胞培養液更換為Opti-MEM培養基，使用LipofectamineTM2000參照其說明書指導做分組轉染6 h，然后棄去Opti-MEM培養基，以細胞培養液繼續無菌培養24 h，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，并參照其說明指導對各組雙熒光素酶相對活性進行測定。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-155對大鼠關節炎指數及后足趾容積的影響

與對照組比較，模型組大鼠關節炎指數及后足趾容積明顯升高(P<0.05)。與模型組、miR-155陰性對照組分別比較，miR-155 antagomir組大鼠關節炎指數及后足趾容積降低(P<0.05)；miR-155 agomir組大鼠關節炎指數及后足趾容積升高(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠關節炎指數及后足趾容積Fig.1 Arthritis index and hind toe volume of rats in each group注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與miR-155陰性對照組相比，cP<0.05。

2.2 miR-155對大鼠關節組織病理形態的影響

對照組大鼠關節形態結構正常，組織無損傷。模型組大鼠關節表面不平整，滑膜層增厚，軟骨侵蝕破壞，有大量炎性細胞浸潤，關節組織呈現較嚴重病理損傷。與模型組、miR-155陰性對照組分別比較，miR-155 antagomir組大鼠關節組織病理損傷減輕；miR-155 agomir組大鼠關節組織病理損傷加重。見圖2。

圖2 HE染色觀察各組大鼠關節組織病理形態(×200)Fig.2 HE staining was used to observe the pathological morphology of joints in each group(×200)

2.3 miR-155對大鼠關節組織炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠關節組織炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平明顯升高(P<0.05)。與模型組、miR-155陰性對照組分別比較，miR-155 antagomir組大鼠關節組織炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平降低(P<0.05)；miR-155 agomir組大鼠關節組織炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平升高(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠關節組織炎性因子IL-6、IL-17、IL-18水平Fig.3 Levels of inflammatory factors IL-6, IL-17, and IL-18 in joint tissue of rats in each group注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與miR-155陰性對照組相比，cP<0.05。

2.4 miR-155對大鼠關節組織PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠關節組織PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組、miR-155陰性對照組分別比較，miR-155 antagomir組大鼠關節組織PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR均降低(P<0.05)；miR-155 agomir組大鼠關節組織PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR水平均升高(P<0.05)。見圖4、5。

圖4 免疫印跡實驗檢測大鼠關節組織PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表達Fig.4 The expression of PI3K/Akt/mTOR pathway proteins in the joint tissue of rats was detected with Western blotting注：A：對照組；B：模型組；C：miR-155 antagomir組；D：miR-155 agomir組；E：miR-155陰性對照組。

圖5 各組大鼠關節組織PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白相對表達水平Fig.5 Relative expression level of PI3K/Akt/mTOR signal pathway proteins in the joint tissue of rats in each group注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與miR-155陰性對照組相比，cP<0.05。

2.5 miR-155對大鼠關節組織miR-155及PIK3R1 mRNA水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠關節組織miR-155水平明顯升高(P<0.05)，PIK3R1 mRNA水平明顯降低(P<0.05)。與模型組、miR-155陰性對照組分別比較，miR-155 antagomir組大鼠關節組織miR-155水平降低(P<0.05)，PIK3R1 mRNA水平升高(P<0.05)；miR-155 agomir組大鼠關節組織miR-155水平升高(P<0.05)，PIK3R1 mRNA水平降低(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組大鼠關節組織miR-155及PIK3R1 mRNA水平Fig.6 MiR-155 and PIK3R1 mRNA levels in the joint tissues of rats in each group注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與miR-155陰性對照組相比，cP<0.05。

2.6 miR-155對PIK3R1的靶向調節

經miRcode數據庫預測miR-155和PIK3R1之間有結合位點，推測PIK3R1可能是miR-155的靶基因。與轉染PIK3R1 3′-UTR無義序列+miR-155 mimics陰性對照組(0.99±0.15)比較，轉染PIK3R1 3′-UTR無義序列+miR-155 mimics組(1.02±0.13)相對熒光素酶活性無明顯差異(P>0.05)。與轉染野生型PIK3R1 3′-UTR報告質粒+miR-155 mimics陰性對照組(1.00±0.18)比較，轉染野生型PIK3R1 3′-UTR報告質粒+miR-155 mimics組(0.31±0.09)相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；與轉染突變型PIK3R1 3′-UTR報告質粒+miR-155 mimics陰性對照組(0.99±0.16)比較，轉染突變型PIK3R1 3′-UTR報告質粒+miR-155 mimics組(1.01±0.25)相對熒光素酶活性無明顯差異(P>0.05)。見圖7。

圖7 miRcode數據庫預測miR-155和PIK3R1之間的結合位點Fig.7 miRcode database predicts the binding site between miR-155 and PIK3R1

3 討論

依據文獻方法[9]誘導RA模型，引發炎癥反應，導致關節腫脹發炎，模型建立成功。研究發現，RA患者體內長期存在炎癥，抑制致炎細胞因子表達及釋放，減輕炎癥是RA治療的關鍵[12]。miR-155是介導炎癥反應的重要因子，脂多糖可促使其表達，引發炎癥并促進其進展；下調miR-155表達，可抑制脂多糖誘導的軟骨細胞炎癥，降低其凋亡率，改善骨關節炎癥狀[13]，本文顯示miR-155 antagomir可降低關節組織miR-155水平，減輕關節組織病理損傷，降低關節炎指數、后足趾容積、關節組織炎性因子IL-6、IL-17及IL-18水平，miR-155 agomir起到相反的作用，表明miR-155參與介導RA的發病與病情進展過程；下調其表達，可減少促炎細胞因子產生，抑制關節炎癥，減輕關節組織損傷，改善關節腫脹等癥狀。

PI3K/Akt/mTOR可介導關節炎疾病，阻斷PI3K/Akt信號途徑，可改善膝骨關節炎大鼠軟骨損傷，減輕大鼠關節炎癥[14]，PIK3R1可負調控PI3K/Akt的激活，抑制PI3KR1表達，增強PI3K、Akt的磷酸化[15]，miR-155可增強PI3K/Akt信號，并靶向下調PIK3R1表達，在白細胞介素-1β誘導的原代軟骨細胞中，miR-155可通過靶向下調PIK3R1激活PI3K/Akt通路，引發軟骨細胞凋亡和分解[16]，本文顯示RA大鼠關節組織PIK3R1 mRNA水平明顯降低，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR水平明顯升高，以拮抗劑antagomir下調miR-155表達，可升高PIK3R1 mRNA水平，抑制PI3K/Akt/mTOR信號激活，miR-155 agomir作用相反。此外，還顯示miR-155能靶向下調PIK3R1的表達，表明miR-155可靶向下調PIK3R1的表達，激活PI3K/Akt/mTOR信號，促進RA病情進展，下調其表達，可增強PIK3R1的表達，阻斷PI3K/Akt/mTOR信號傳導，抑制炎癥，減輕關節組織損傷，改善RA大鼠關節炎癥狀。

綜上所述，miR-155在RA大鼠中高表達，下調其表達，可上調PIK3R1表達，抑制PI3K/Akt/mTOR信號激活，阻止炎癥反應發生發展，減輕關節組織損傷，改善RA大鼠關節腫脹等癥狀，證實靶向PIK3R1調控PI3K/Akt/mTOR信號表達是調節RA大鼠病情的作用機制之一，是否有其他通路間接參與調控RA大鼠病情，還有待進一步實驗加以說明。