晝夜節律與缺氧誘導因子途徑對缺氧性心肌損傷影響的研究進展

鄧 捷，賀建東，韓沖芳

晝夜節律是大約24 h的生物節律，可以使機體為晝夜周期帶來的波動做好準備，使體內生物學功能與環境變化保持一致。在哺乳動物中，晝夜節律受生物鐘的調節。生物鐘可以分為位于下丘腦視交叉上核中的中央時鐘[1]以及幾乎存在于每個組織中的外圍時鐘[2]。光作為主要生物鐘輸入信號，通過視網膜轉化為神經脈沖傳輸至視交叉上核的中央時鐘，中央時鐘將神經和體液信號傳遞到身體其他組織的外周時鐘，使細胞時鐘同步[3]。外周時鐘除了接受中央時鐘發出的信號，還響應其他組織特定的同步信號(例如食物攝入和鍛煉)[4-6]。生物鐘是心血管生理與疾病的重要調節器，心肌細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞中都存在外周時鐘[7-10]，調節各種病理及生理功能，例如內皮功能、血壓、心率及急性心肌梗死、心律失常的發生[11]。

1 生物鐘的分子機制

生物鐘由復雜的自動調控性轉錄-翻譯反饋環組成，它們通過相互作用使生物鐘控制的基因節律性表達，最終導致蛋白質組和細胞功能的振蕩[12]。主反饋回路由核心生物鐘基因組成，包括：芳烴受體核轉運蛋白樣蛋白(BMAL)1，生物鐘運動輸出周期蛋白kaput(CLOCK)，花隱色素(CRY)1、CRY2，周期生理蛋白(PER)1、PER2、PER3[13]。次要反饋回路由孤兒核受體(ROR)1、ROR2、視黃酸受體相關的孤兒受體Rev-erbα(也稱為NR1D1)組成[14]。在24 h晝夜節律開始時，BMAL1和CLOCK蛋白形成復合物(異二聚體)。BMAL1-CLOCK異二聚體與PER和CRY時鐘基因的增強子元件(E-box)結合，激活其轉錄和翻譯(正反饋)。PER和CRY在細胞質中聚積，然后也形成異二聚體并轉運至細胞核，從而抑制BMAL1-CLOCK的轉錄活性，并因此抑制其編碼基因的轉錄(負反饋)。生物鐘的核心元素(例如BMAL1和CLOCK)不僅可以保持時鐘轉動，而且還可以與時鐘控制基因的E-box結合，從而實現大部分基因組24 h有節奏地激活。BMAL1-CLOCK異二聚體還激活ROR和Rev-erbα，這些組件競爭性結合位于BMAL1啟動子區域的ROR反應元件(RORE)，從而導致BMAL1轉錄的激活或抑制。ROR1和ROR2充當BMAL的轉錄激活因子，而Rev-erbα抑制BMAL1轉錄[15]。對于BMAL1的節律性表達這個次級反饋回路是必不可少的。晝夜節律還受其他各種過程的調節，并且與這些反饋回路相輔相成。

2 缺氧誘導因子(HIF)途徑傳感細胞氧信號

HIF-1是哺乳動物細胞中氧穩態的中心調節因子。HIF-1是一種異二聚體轉錄因子并且在缺氧(低氧)條件下被激活。在含氧量正常的條件下，HIF-1α中氧依賴性降解結構域(ODD)的脯氨酸殘基處被脯氨酰羥化酶(PHD)羥基化，然后與E3泛素連接酶(von hippel-lindaum，VHL)結合，泛素化后被蛋白酶體降解。缺氧會抑制PHD的功能，從而導致HIF-1α穩定。在缺氧狀態下，穩定的HIF-1進入細胞核，并與其靶基因啟動子或增強子區域的缺氧反應元件(HRE)結合，這對細胞適應缺氧至關重要。這些靶基因中含有許多表達代謝酶的基因，這些基因對于調節低氧條件下的代謝平衡非常重要，而且低氧條件下代謝途徑產生的特定代謝物和活性氧(ROS)會抑制PHD[16]。HIF-1在與缺氧有關的心血管疾病中也起著作用[17-18]。

3 HIF和晝夜節律之間的雙向作用

晝夜節律與HIF途徑相互聯系的一種方式是，它們都涉及含PAS結構域的蛋白質[19]。HIF-1α、HIF-1β、BMAL1和CLOCK都是堿性螺旋-環-螺旋蛋白(bHLH)-PAS轉錄因子超家族的一部分[20]，bHLH-PAS轉錄因子感知并響應生理和環境信號。HIF-1不僅可以與BMAL1結合調節晝夜節律基因表達，還會隨著BMAL1/CLOCK改變而產生晝夜節律震蕩，除此之生物鐘和HIF途徑還可以通過間接機制相互作用，生物鐘通過控制代謝通量對HIF-1α進行晝夜節律控制。

3.1 HIF與E-box和BMAL1結合調節晝夜節律基因表達 研究發現，HIF-1α和HIF-2α與晝夜節律因子BMAL1之間有直接物理相互作用的潛力，從而影響動物模型及人類中晝夜節律基因的表達。在電泳遷移率變動分析中HIF-1α和BMAL1能夠直接彼此結合，可以在特定條件下形成異二聚體發生共免疫沉淀，并結合了E-box DNA元件，共表達激活了E-box驅動的熒光素酶報道基因。在骨骼肌細胞和人骨肉瘤細胞(U2OS)中，用HIF-α活化藥物二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)處理后可延長生物鐘基因的晝夜節律周期，并降低PER2和BMAL1的振幅，提示HIF-1α與E-box結合會導致晝夜節律紊亂[21-22]。在斑馬魚中，低氧暴露降低了PER2基因的晝夜節律振幅，而CLOCK的遺傳破壞降低了對急性低氧反應的HIF-1α活化和活性[23]。氧水平不僅會影響分子時鐘功能，而且會影響動物的整個行為學[24-25]。

3.2 HIF-1α基因中含有啟動子E-box HIF-1α基因在其啟動子區域包含一個E-box序列，并且在U20S細胞中使用結合位點分析法(ChIP-seq)觀察到BMAL1/CLOCK與HIF-1α啟動子區域的直接結合。在小鼠肝臟、心臟和腎臟中，HIF-1α mRNA轉錄物具有晝夜節律振蕩[25-26]。在小鼠骨骼肌細胞中，BMAL1的低表達也會降低HIF-1α活性和糖酵解。BMAL1/CLOCK通常會與諸如PER和CRY等生物鐘基因中的E-box結合，并且鑒于HIF-1α基因包含一個E-box，在小鼠中BMAL1/CLOCK在白天趨于高峰時，HIF-1α的表達在BMAL1/CLOCK活性最大時期達到峰值[21]。小鼠在活動期間(對應于人類的白天)進行運動時，低氧對HIF-1α靶基因有更大的誘導作用，這表明晝夜節律控制著對骨骼肌運動的HIF依賴性轉錄反應[21]。

3.3 生物鐘基因CRY1和PER2與HIF-1α相互作用以改變低氧反應 CRY1能夠維持晝夜節律周期長度和振幅，并直接與HIF-1α相互作用從而改變了低氧反應[18，24]。低氧小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)進行的免疫共沉淀分析發現，CRY1的尾部區域可以與HIF-1α的bHLH域結合。HIF-1α的bHLH結構域需要與靶基因的啟動子結合才可啟動其轉錄，而CRY1與HIF-1結合后抑制HIF-1轉錄激活作用，并縮短了HIF-1α的半衰期[24]。相反，在缺氧的Hela細胞中，PER2可以直接與HIF-1α結合，并且充當效應蛋白將HIF-1募集到HRE區域。PER2可增強HIF-1活性，而不會在mRNA或蛋白質水平上影響HIF-1α的表達[27]。PER2對于缺氧狀態下的HIF-1α穩定是必需的，眾所周知HIF-1α在低氧代謝適應中的作用，并在隨后的研究確定PER2是碳水化合物代謝的調節劑并且在心肌損傷期間具有心臟保護作用，因此兩者在心肌缺血再灌注可能通過代謝調節共同發揮作用。

3.4 晝夜節律和HIF-1α的連接點：Sirtuins 低氧和晝夜節律之間的雙向關系的另一個層面包括與Sirtuins的連接，Sirtuins及其輔助因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+在晝夜節律的控制下，因此代謝調節途徑可能處于生物鐘-HIF-1α連接的十字路口。核沉默蛋白(SIRT)1、SIRT6、SIRT7負責有節奏的組蛋白乙酰化，表示生物鐘基因對Sirtuins的晝夜節律有控制作用[28-29]。SIRT1可以直接使HIF-1α脫乙酰化，從而使HIF-1α失活[30]。缺氧下，HIF-1α的乙酰化和活性加劇，這在很大程度上是由于NAD+減少后SIRT1受到抑制。在常氧條件下，SIRT6可以抑制糖酵解基因的表達，表明其作為組蛋白脫乙酰基酶的功能來抑制HIF-1α[31]，SIRT6可能通過減弱HIF-1α轉錄輸出而促進線粒體的氧化代謝[32]。線粒體SIRT3是癌細胞中Warburg效應(在存在大量可用氧的情況下進行糖酵解)的關鍵調節劑，它通過使HIF-1α不穩定來實現。在沒有SIRT3的情況下，ROS會因此增加，隨之HIF-1α的穩定性就會增加。研究表明SIRT3在缺血和再灌注損傷模型中具有心臟保護作用，并且SIRT3保護心肌細胞免受氧化應激的影響[33-35]。

4 心血管疾病中的晝夜節律紊亂與缺氧

低氧在心血管疾病的病理生理中起著至關重要的作用，這些缺氧性疾病的發生和后遺癥經常表現出晝夜節律變化[36]，這表明低氧和晝夜節律途徑之間的相互作用可能對人類健康產生重要影響。HIF通過包括代謝適應，血管生成和干細胞生態在內的關鍵途徑在缺氧或局部缺血中的心臟保護作用已被充分證實。例如，PHD基因缺失可能夠穩定HIF-1α，可通過包括血管內皮生長因子(VEGF)促血管生成信號通路和內皮一氧化氮合酶通路等途徑增加血管生成和恢復心肌梗死后心功能[37-38]。七氟烷預處理后通過蛋白激酶B(Akt)信號激活HIF-1α，再激活下游血管內皮生長因子增加血管生成可以有效改善病變區域的缺氧情況，抑制缺血/再灌注損傷[39]。為了增加灌注，HIF-1激活誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和增加細胞色素氧化酶亞基4-2(COX4-2)表達，從而增加一氧化氮的產生，導致血管舒張，增加細胞的血液和氧氣供應[40-41]。此外，心臟外植體的細胞或內皮細胞中通過低氧或PHD抑制劑穩定HIF-1α的相關實驗揭示了HIF-1α在成體干細胞中的潛在作用，包括調節心臟干細胞參與增殖的標記基因與涉及多能干細胞端粒酶(TERT)基因表達[42-43]。還觀察到HIF-2α和Oct4在胚胎樣間充質干細胞(vselMSCs)中協同上調它們的靶基因，包括促血管生成因子促血管生成素-1(Ang-1)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子以及抗凋亡蛋白(Bcl2)、促凋亡蛋白(Caspase-3)，從而誘導血管生成、分化和抗凋亡，HIF-2α促進了人極細小胚胎樣間充質干細胞(vselMSCs)在心肌梗死中的存活和心肌修復[44]。

重要的是，缺氧的干細胞必須調節細胞代謝，以維持適當的細胞干性或增殖能力和分化能力，而這些都與HIF密切相關[45]。在常氧狀態下，三羧酸循環將NAD+和FAD 還原為還原型輔酶Ⅰ(NADH)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH)2，后者通過氧化磷酸化而被氧化。然而，在缺氧期間，線粒體呼吸鏈阻止了NADH和FADH2被氧化。因此，當氧氣的可用性受到限制時，HIF-1介導的代謝適應使代謝物脫離線粒體以調節TCA循環通量和氧化磷酸化；通過丙酮酸脫氫酶磷酸化抑制乙酰輔酶a進入三羧酸循環；通過誘導Bnip3(促進線粒體自噬)和Mxi1(線粒體生物發生的負調節劑)增強線粒體自噬降低呼吸能力，從而總體上降低ROS的產生[46]。組織缺氧會觸發HIF-1α/HIF-1穩定，BNIP3L依賴的線粒體也調節促炎性M1巨噬細胞的極化，其在炎癥反應過程中經歷糖酵解依賴性分化[47]。揭示了缺氧狀態下，線粒體吞噬和代謝重編程之間的新聯系。HIF-2α通過上調其靶基因雙調蛋白(AREG)、心肌中表皮生長因子受體1(ERBB1)和激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號通路在增加缺血耐受性[48]。對HIF在心臟缺血事件或干細胞在低氧環境的代謝適應的了解，可能有助于進一步說明HIF-1α和HIF-2α在缺血再灌注損傷中發揮的作用。

最近的研究表明，心肌細胞內在的晝夜節律可能與心血管生理的時間依賴性有關。在人類中心肌梗死的發作也表現出明顯的晝夜節律，與夜晚相比，清晨的發病率增加[36，49-51]。圍術期心肌損傷的病人中，晝夜節律基因表達在轉錄水平發生改變[52]。Reiter等[53]報道在ST段抬高型心肌梗死后心肌梗死面積大小和左心室功能具有晝夜節律的依賴性。有很多證據支持 BMAL1基因敲除和Clock-mutant小鼠具有內皮功能障礙。BMAL1基因在內皮細胞中的遺傳消融會增強Ccl8、Ccl20和Cxcl5損害內皮完整性和屏障功能[54]。此外，Gao等[55]研究認為，生物鐘可能驅動內皮細胞表達細胞間黏附分子-1并促進單核細胞黏附到內皮細胞。小鼠中的PER2基因導致主動脈內皮細胞相關功能障礙，可能與一氧化氮和前列環素產生減少和環氧化酶-1增加有關[56]。一般而言，晝夜節律對于維持正常的內皮細胞功能很重要。

BMAL1以時間依賴性方式調節PI3K，在心臟外組織中胰島素敏感性處于晝夜節律控制下所以胰島素信號級聯反應中PI3K的下游成分，即AKT和GSK3β，受心肌細胞晝夜節律的調節[57]。除此之外，有研究表明敲除BMAL1基因后H2S通過PI3K / Akt信號通路抑制線粒體凋亡的功效受損，心肌保護作用減弱[58]。Clock△19/+小鼠中蛋白酶體和自噬對BMAL1降解的雙重衰減有助于改善葡萄糖穩態，說明BMAL1在心肌細胞的糖代謝中發揮重要作用[59]。這些研究共同強調了BMAL1基因在保護心肌中的新功能。缺血和I/R損傷后心肌中NAD+的含量均降低，多種NAD+前體包括NA，NAM，NMN和NAD+本身可以恢復NAD+水平，減少心肌梗死(MI)大小并防止體內I/R損傷[60]。NAD+補充可以通過多種機制發揮心肌保護作用包括減少氧化應激，防止自噬過度激活，線粒體功能的恢復以及RISK的激活。先前的研究表明，Nampt 基因表達受CLOCK和BMAL1以及SIRT1的調節，從而導致有節律性維持細胞NAD+水平[61]。細胞中缺乏BMAL1導致SIRT3活性降低和線粒體蛋白乙酰化增強，從而導致氧化酶功能降低。最后，用NMN補充NAD+可以恢復晝夜節律突變小鼠的SIRT3靶蛋白脫乙酰并增強線粒體功能。生物鐘節律性調節NAD+生物合成，使線粒體的氧化能力發生振蕩。使用NAD+作為晝夜節律和代謝周期耦合的中心環節可提供一種快速且可逆的機制，使細胞改變線粒體的氧化功能以適應明暗周期變化[62]。

HIF-1α預處理心臟，使其具有更有效的氧代謝特性，并為缺氧的心肌提供心臟保護作用。HIF和晝夜節律網絡之間的相互作用有助于這種反應。強光誘導使HIF-1α-HRE結合增強，以增加外周血PER2介導的心臟保護作用[63]。此外Per2還可以通過ADORA2B依賴性途徑穩定HIF-1α，這對心肌適應缺氧反應至關重要[26]。Wu等證明了時鐘網絡通過調節具有心臟保護作用的HIF-1的靶基因和心肌損傷(如BNIP3引起的凋亡)之間的平衡來應對心肌梗死的低氧反應。最終作者得出結論，晝夜節律性時鐘有助于保護心臟免受缺氧引起的細胞死亡[22]。

5 結 語

盡管最近的工作揭示了脊椎動物動物模型以及人類中晝夜節律與氧氣感應通路之間的新穎聯系，但仍然存在一些核心問題。首先，CLOCK-HIF 通路是如何在機械水平上相互作用的？時鐘和HIF因子是否直接bHLH-PAS域異二聚化，或者是否存在間接途徑，仍然是未知的。需要基因組學研究來確定生物鐘轉錄因子和HIF因子在染色質上轉錄調控位點的相互作用，以充分確定兩者是否直接異源二聚化，以及它們是否在體內形成轉錄復合物。另外有必要分析和了解缺氧應激條件下生物鐘驅動的代謝通量的全部范圍，以確定生物鐘是否調控其他的HIF調節代謝產物(例如琥珀酸酯、富馬酸酯、α-酮戊二酸酯、2-羥基-α- 酮戊二酸、ROS)。

最后，還有其他機制可以將生物鐘與低氧反應聯系起來嗎？在哺乳動物細胞中，還有許多其他的氧敏感蛋白，包括含有Jumonji結構域的組蛋白賴氨酸和精氨酸脫甲基酶家族，它們表現出與缺氧誘導因子PHD1-3和低氧誘導因子-1抑制因子(FIH)相似的α-酮戊二酸依賴性加氧酶活性。多項研究表明，該家族成員(例如JMJD5)與植物、果蠅和哺乳動物細胞的中央時鐘功能之間存在聯系，并且表明小鼠肝臟中存在約24 h的組蛋白甲基化節律[64]。然而，氧依賴性脫甲基酶決定晝夜節律的程度以及缺氧是否可以通過蛋白質脫甲基化來重新編程晝夜節律轉錄仍未得到很好的研究。

隨著發現生物鐘與代謝調節劑之間的新聯系，不僅要考慮生物鐘對日常基礎代謝穩態的控制，而且還要考慮生物鐘如何預測晝夜節律中不同時期的環境壓力。在這個概念上，保守進化的CLOCK與HIF通路的相互作用就是一個有趣且據有潛在治療意義的解釋。總體而言，對晝夜節律與低氧通路之間聯系的研究將為深入了解缺氧性心肌損傷提供新見解。