兒童H3K27M突變型膠質瘤病理分子機制及靶向藥物研究進展

鄧后亮，李亞冰，楊金連，魏媛怡，梁倩瑩，何艷玲

(1.廣州市婦女兒童醫療中心藥學部，廣州 510623； 2.廣東省婦幼保健院藥學部，廣州 510010)

膠質瘤是兒童中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，也是兒童最常見的腫瘤相關致死性疾病，根據病理組織學特征及惡性程度可將其分為低級別(世界衛生組織Ⅰ～Ⅱ級)和高級別(世界衛生組織Ⅲ～Ⅳ級)兩大類。兒童低級別膠質瘤大多進展緩慢，而高級別膠質瘤惡性程度極高，患兒大多預后不良，5年生存率低于1%[1]。兒童與成人膠質瘤的病理機制截然不同，導致其對目前的標準治療不敏感，這是兒童膠質瘤預后差的關鍵原因。然而，2012年該領域獲得了一個突破性發現，即大部分兒童高級別膠質瘤患者攜帶的組蛋白H3第27位賴氨酸被甲硫氨酸替代(histone H3 lysine to methionine substitution on position 27，H3K27M)，其主要特征為編碼組蛋白H3的基因H3F3A或HIST1H3B發生突變[2-3]。H3K27M突變是兒童高級別膠質瘤重要的分子生物學基礎。雖然在研究早期已經明確了H3K27M突變型膠質瘤的發生發展與多梳蛋白抑制復合體2(polycomb repressive complex 2，PRC2)活性被抑制而導致細胞H3K27三甲基化(H3K27 trimethylation，H3K27me3)修飾等表觀遺傳調控異常密切相關，但目前對H3K27M突變影響膠質瘤細胞生物學過程以及基因表達的研究仍處于快速發展時期。此外，近年來鑒定出多種在實驗室水平具有潛在靶向治療H3K27M突變型膠質瘤的藥物。現就兒童H3K27M突變型膠質瘤病理分子機制及靶向藥物研究進展予以綜述，以為后續深入研究提供基礎。

1 兒童H3K27M突變型膠質瘤概述

組蛋白是核小體的重要組成部分，與維持染色質結構和調控基因表達相關。在哺乳細胞中，組蛋白H3存在多種變異體，包括H3.1、H3.2、H3.3、CENPA、H3.4、H3.5、H3.X和H3.Y等[4]。兒童H3K27M突變型膠質瘤的主要亞型為H3.3K27M和H3.1K27M，該發現于2012年被首次報道[2-3]。其中，Wu等[2]報道高達78%的彌漫性內生型腦橋膠質瘤以及22%的膠質母細胞瘤的患兒攜帶H3K27M突變。與此同時，Schwartzentruber等[3]研究發現大約36%的兒童膠質母細胞瘤中存在H3K27M突變。后續國內外眾多研究進一步證實了兒童高級別膠質瘤中存在高頻度的H3K27M突變[5-7]。H3K27M突變型膠質瘤發生部位具有較強的特異性，主要發生于中樞神經系統的腦干、丘腦及脊髓等部位[8]。除了兒童，近年來研究發現少部分年輕的成年膠質瘤患者同樣攜帶H3K27M突變[9]。與非突變患兒相比，H3K27M突變型膠質瘤患兒的預后往往更差[10]。由于H3K27M突變型膠質瘤表現出不同的分子機制以及預后的差異，2016年世界衛生組織的中樞神經系統腫瘤分類第四版修訂將H3K27M突變型彌漫性中線膠質瘤單獨歸為一類[11]。

2 兒童H3K27M突變型膠質瘤病理分子機制

2.1H3K27M突變導致細胞表觀遺傳調控異常 組蛋白可接受甲基化、乙酰化、磷酸化等多種翻譯后修飾，這些修飾與基因表達關系密切，是表觀遺傳調控的一種重要方式[12]。H3K27既可被甲基化也可以被乙酰化，其中H3K27me3介導的基因轉錄抑制是基因沉默的標志；而H3K27乙酰化(H3K27 acetylation，H3K27ac)則與基因激活密切相關[13]。目前鑒定出多種表觀遺傳調控因子催化或去除H3K27me3修飾，其中PRC2負責催化H3K27me3[14]。PRC2由多梳家族蛋白構成，在哺乳細胞中該復合體由Zeste基因增強子同源物(enhancer of Zeste homolog，EZH)1/2、胚胎外胚層發育蛋白、Zeste 12同源物1抑制因子2三種核心蛋白構成，其中EZH1/2具有甲基轉移酶活性。PRC2抑制基因表達與H3K27me3修飾密切相關，目前的主流觀點認為是胚胎外胚層發育蛋白與染色質上已存在的H3K27me3修飾結合，繼而EZH1/2三甲基化鄰近核小體的H3K27修飾，最終促使H3K27me3修飾在染色質上的延伸而沉默基因[14]。研究表明，PRC2表達異常及其介導的H3K27me3修飾紊亂引起的細胞基因表達譜的改變與膠質瘤發生發展關系密切[15]。

H3K27M突變發生在可被修飾的位點，大量證據表明H3K27M突變降低細胞H3K27me3修飾整體水平，繼而改變細胞基因表達譜[16-18]。Lewis等[16]報道，H3K27M突變型膠質瘤細胞中H3K27M含量只占細胞H3的3%～17%，然而H3K27me3修飾整體水平卻顯著低于非突變型，且在不同細胞中表達的H3K27M均會引起H3K27me3修飾水平的顯著下降。體外酶促反應顯示，H3K27M多肽可以顯著降低PRC2活性及其介導的H3K27me3修飾水平[16]。該研究還發現，H3K27M可以與EZH2的SET結構域結合，而該結構域是EZH2發揮甲基轉移酶活性所必需的。以上結果表明，H3K27me3修飾水平降低不僅由于該位點不能被修飾，更有可能是該突變體具有“dominant-negative”功能，通過與EZH2的SET結構域結合抑制PRC2活性，從而導致細胞中具有活性的PRC2減少。此外，有學者成功解析了PRC2的空間立體結構，并進一步明確H3K27M突變抑制PRC2活性，他們發現與野生型相比，H3K27M突變與PRC2的結合能力更強，而且突變型和野生型與PRC2結合的平衡解離常數相差10倍之多[19]。值得注意的是，雖然H3K27M突變顯著降低細胞H3K27me3修飾的整體水平，但它會增加染色質局部區域H3K27me3修飾水平[20]。基于以上證據，H3K27M突變改變H3K27me3修飾可能由于其與EZH2結合使PRC2富集在染色質特定區域，繼而PRC2在染色質上的延伸受到抑制，導致細胞H3K27me3修飾整體水平下降以及染色質局部區域H3K27me3修飾水平的升高。

已知H3K27既可以被甲基化，同時也可以接受乙酰化，而且這兩種修飾在調節基因表達上存在相互拮抗作用。研究發現，H3K27M突變會引起細胞H3K27ac修飾水平整體升高，導致靶基因激活[16,21]。然而，目前尚不清楚H3K27ac修飾增加是由于H2K27位點的甲基化水平下降還是H3K27M突變影響了相關的乙酰化酶和(或)去乙酰化酶。除了影響H3K27位點的修飾外，H3K27M突變同樣可導致DNA低甲基化[18]。DNA低甲基化可影響染色質的穩定性而驅動腫瘤的發生發展，這或許也是H3K27M突變造成基因表達紊亂繼而促進膠質瘤發生發展的分子機制之一。

綜上所述，H3K27M突變發揮原癌作用與其擾亂H3K27me3和H3K27ac修飾以及DNA甲基化等表觀遺傳調控密切相關。

2.2H3K27M突變對膠質瘤細胞生物學過程的影響 由于H3K27M突變對多種表觀遺傳調控有全局性的影響，該突變可能對多種細胞生物學過程有重要影響。截至目前，學者從多層次、多角度證實了H3K27M突變可調控多個與腫瘤密切相關的生物學過程。

2.2.1H3K27M突變對細胞增殖的影響 細胞異常增殖是膠質瘤發生最為突出的特征之一。H3K27M突變在體外能夠促進人來源的神經前體細胞的增殖[22]。H3K27M突變促進細胞增殖可能與其沉默細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白p16INK4A密切相關[23]。研究發現，H3K27M突變通過調控p16INK4A啟動子區H3K27me3修飾和DNA甲基化水平沉默其表達。然而，有研究顯示H3K27M突變對兒童膠質瘤細胞周期和增殖并沒有影響[24]。這可能由于研究過程中使用的細胞種類不同造成H3K27M突變對細胞增殖的影響結果不一致。

2.2.2H3K27M突變對細胞代謝的影響 代謝改變是癌癥的普遍標志特征之一，腫瘤細胞更傾向于吸收和代謝葡萄糖和谷氨酰胺以此維持其關鍵的生物合成過程。Chung等[25]報道，H3K27M突變可能會引起細胞能量代謝紊亂。該研究的體外、體內實驗結果均顯示，H3K27M突變增加膠質瘤細胞糖酵解、谷氨酰胺代謝和三羧酸循環等代謝水平以及伴隨α-酮戊二酸產生的增加，而將H3K27M突變細胞中能量代謝相關的關鍵酶，如谷氨酸脫氫酶、己糖激酶 2、異檸檬酸脫氫酶1敲降或抑制后，細胞增殖被顯著抑制。基于上述研究結果，靶向能量代謝酶可能是有效的治療策略。

2.2.3H3K27M突變對膠質瘤干細胞的影響 膠質瘤干細胞是膠質瘤中具有自我更新能力并能產生異質性腫瘤細胞的細胞，對膠質瘤的存活、增殖、轉移及復發有重要作用。B細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點1(B-cell specific Moloney murine leukemia virus integration site 1，BMI1)是膠質瘤干細胞的標志蛋白之一，對維持膠質瘤干細胞自我更新不可或缺。Balakrishnan等[26]發現，BMI1表達水平及其催化的組蛋白H2A第119位賴氨酸單泛素化修飾水平在H3K27M突變型膠質瘤中上調；體外實驗顯示，H3K27M突變通過降低BMI1啟動子區組蛋白H3K27me3修飾水平而激活其表達，而敲降或抑制BMI1可降低H3K27M突變型膠質瘤細胞自我更新能力。

2.2.4H3K27M突變對上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影響 EMT是由上皮細胞表型向間質細胞表型轉化的生物學過程，其異常往往導致中樞神經系統無法正常發育。Sanders等[27]利用生物信息學系統性分析已公開發表的相關數據庫，發現兒童H3K27M突變型膠質瘤表達異常基因富集于EMT過程；進一步研究發現，H3K27M突變可上調EMT關鍵轉錄因子蝸牛家族轉錄抑制因子1以及下調Twist相關蛋白1的表達。蝸牛家族轉錄抑制因子1和Twist相關蛋白1分別是EMT啟動和完成的標志蛋白，上述研究結果提示，H3K27M突變可能會阻滯細胞停留在EMT的初始階段，造成細胞無法順利完成EMT，這使得細胞分化受阻，細胞處于一種可增殖的干細胞狀態，最終導致腫瘤的發生發展。

2.2.5H3K27M突變與其他基因突變的相互作用 研究發現，兒童H3K27M突變型膠質瘤患者中同時存在其他基因的突變[3,28]。雖然目前普遍認為，H3K27M突變是兒童高級別膠質瘤發生的初始啟動突變，然而該突變可能與其他基因的改變協同促進腫瘤的發生和發展。p53是細胞中重要的抑癌基因，它的突變或缺失均可促進膠質瘤發生發展，而大部分兒童H3K27M突變型膠質瘤中存在p53基因的突變[3]。α地中海貧血伴智力低下綜合征X連鎖(alpha thalassemia retardation syndrome X-linked，ATRX)基因編碼染色體重塑蛋白，其表達缺失可影響H3.3與著絲粒區和端粒區異染色質的結合，導致染色體結構損害、基因組不穩定以及發生端粒延長替代機制，造成端粒的異常延長，使腫瘤細胞獲得無限增殖的能力，最終引發癌變。研究發現，ATRX基因突變與H3K27M突變存在重疊[3]。此外，酪氨酸激酶信號通路的關鍵蛋白往往在H3K27M突變型患者中被激活，如血小板源性生長因子受體α[3]。另外，轉化生長因子(轉化生長因子-β)超家族受體激活素A受體1蛋白，可激活骨形態發生蛋白/轉化生長因子-β信號通路，而在兒童膠質瘤患者中H3K27M突變與激活素A受體1基因突變存在較高的關聯性[28]。上述這些基因突變或表達異常往往與腫瘤發生發展有關，提示它們或許與H3K27M突變有一定程度的交互作用。

目前有研究初步探討了上述設想。如Pajovic等[29]發現，H3K27M突變型轉基因小鼠形成血液腫瘤和癌癥的概率大幅增加，但是并未發現膠質瘤的形成，然而聯合p53缺失，小鼠即可自發形成膠質瘤。有研究表明，單獨H3K27M突變可促進細胞增殖和細胞遷移侵襲能力，但是對細胞惡性轉化并沒有明顯影響，而進一步敲降p53并激活血小板源性生長因子受體α表達，能更大程度地促進細胞增殖，并使細胞獲得腫瘤表型[22]。另有研究發現，將H3K27M突變以及p53和ATRX基因敲降的小鼠神經祖細胞移植到小鼠顱內，即可形成腫瘤，而在此基礎上再過表達血小板源性生長因子受體α則可縮短腫瘤形成所需要的時間[30]。上述研究表明，H3K27M突變型膠質瘤的發生可能不是H3K27M單一突變造成，而是該突變與其他基因突變或改變共同作用的結果。

3 兒童H3K27M突變型膠質瘤靶向藥物

目前，臨床治療兒童H3K27M突變型膠質瘤的標準方案仍是參照成人的治療方案，主要包括手術、放療和化療，但最終的結局仍不理想。在研究人員不懈的努力下，近年來發現多種藥物在實驗室顯示出良好的抗H3K27M突變型膠質瘤效果，這為將來有效治療H3K27M突變型膠質瘤提供了可能性。

3.1表觀遺傳藥物 H3K27me3修飾異常是H3K27M突變促進膠質瘤發生發展的基礎，研究發現逆向改變H3K27me3修飾是一個很有潛力的治療策略[20,31]。Hashizume等[31]報道，H3K27去甲基化酶家族成員含十字形結構域蛋白3抑制劑GSKJ4可以恢復H3K27M突變腫瘤細胞H3K27me3修飾水平，并能特異性抑制H3K27M突變腫瘤細胞增殖和克隆形成，且抑制腫瘤細胞在小鼠體內成瘤的能力。另有研究發現，EZH2抑制劑(GSK343和EPZ6438)通過調控p16INK4A抑制H3K27M突變膠質瘤細胞在體外和體內的生長[20]。

研究表明，參與調控組蛋白H3K27ac修飾的蛋白也是一類很有前景的藥物靶點[32-33]。JQ1是BET(Bromodomain and Extra Terminal domain)的抑制劑，它能降低膠質瘤細胞H3K27ac修飾水平，并抑制H3K27M突變型膠質瘤細胞增殖以及促進細胞分化，且上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白p21和細胞分化標志蛋白(微管蛋白β3和微管相關蛋白2等)的表達[32]。Grasso等[33]的研究顯示，多種組蛋白去乙酰化酶抑制劑體外和體內均顯示出較好的抗兒童膠質瘤活性。其中，美國食品藥品管理局已批準上市的用于治療多發性骨髓瘤的藥物帕比司他抗H3K27M突變型膠質瘤活性最強，可增加腫瘤細胞死亡以及減少細胞增殖，而且還發現帕比司他可下調與腫瘤細胞增殖密切相關基因MKI67 和CCND1的表達。目前該藥物正在兒童膠質瘤患者中進行Ⅰ期臨床試驗(NCT02717455)。

3.2細胞周期抑制劑 p16INK4通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4和6阻止細胞進入S期，而p16INK4是H3K27M突變促進膠質瘤細胞增殖的關鍵下游基因。研究發現，細胞周期蛋白依賴性激酶4和6特異性抑制劑帕博西尼能夠有效阻止H3K27M突變細胞進入S期，而且不影響非突變細胞周期[23]。另有研究發現，細胞周期蛋白依賴性激酶7抑制劑THZ1可以減少H3K27M突變型膠質瘤細胞增殖和增加細胞凋亡[34]。THZ1具有良好的血腦屏障透過性，通過靜脈注射時腦實質可達到的濃度遠高于其抗癌所需濃度。體內實驗發現，尾靜脈注射THZ1可顯著抑制膠質瘤原位移植小鼠腫瘤的生長，并明顯延長模型小鼠的中位生存期[34]。而且，THZ1與其他潛在的治療藥物具有良好的抗H3K27M突變型膠質瘤協同作用，如JQ1和帕比司他。

3.3腫瘤免疫治療藥物 免疫治療藥物主要包括免疫檢查點抑制劑、嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)和腫瘤疫苗等。有研究發現，雙唾液酸神經節苷脂2(disialoganglioside 2，GD2)在H3K27M突變型膠質瘤細胞中高表達，而GD2特異性CAR-T細胞可獨立產生γ干擾素和白細胞介素-2，并能在體外特異性殺傷腫瘤細胞；H3K27M突變型膠質瘤原位移植小鼠尾靜脈注射抗GD2 CAR-T細胞后，小鼠顱內僅殘留極少數不表達 GD2 的腫瘤細胞，表明CAR-T細胞在H3K27M突變型膠質瘤中有潛在的治療效果[35]。除了CAR-T細胞，腫瘤疫苗也可能是一種有價值的治療藥物。Ochs等[36]設計了抗H3K27M突變的多肽疫苗，結果顯示該疫苗可激活小鼠細胞免疫而發揮抗膠質瘤活性。然而，該研究結果是基于皮下腫瘤模型，該多肽疫苗在顱內抗腫瘤的效果還需要進一步明確。另一類可作為免疫治療的理想靶點為腫瘤/睪丸抗原，它們通常只在睪丸組織中表達，但是往往在腫瘤中高表達。研究發現，H3K27M突變可以激活兒童膠質瘤細胞中多種腫瘤/睪丸抗原，如VCX3A(variable charge X-linked 3A)和白細胞介素-13受體α2等[24]。利用干擾小RNA敲降VCX3A能夠特異性減少H3K27M突變型膠質瘤細胞增殖。由于抗白細胞介素13受體α2 CAR-T細胞治療方案在成人膠質瘤中顯示出良好的抗癌活性[37]，因此探究其抗兒童H3K27M突變型膠質瘤活性具有重要意義。

4 小 結

兒童H3K27M突變型膠質瘤病理機制與成人膠質瘤截然不同，這解釋了基于成人臨床數據的分子靶向治療策略對兒童患者效果不佳的原因。由于攜帶H3K27M突變基因膠質瘤患者的預后更差，臨床通常會利用免疫組織化學、熒光定量聚合酶鏈反應、Sanger測序等技術明確其基因型[38]。近年來，對H3K27M突變型膠質瘤發生發展的分子機制以及靶向治療藥物等研究取得了很大進展，但是尚需對以下幾個方面進行更深入的研究：①H3K27M突變增加染色質局部特定區域H3K27me3修飾水平的機制；②H3K27M突變上調H3K27ac修飾以及引起DNA低甲基化的分子機制；③H3K27M突變型膠質瘤中通常伴隨其他基因突變，它們是否與H3K27M突變存在相互交聯及其交聯的分子機制；④在實驗室水平多種藥物顯示出對H3K27M突變型膠質瘤有靶向治療效果，但是這些藥物的生物利用度、血-腦屏障和血-腫瘤屏障穿透程度、藥動學、腫瘤組織藥物濃度等需要明確。因此，未來尚需進行更多研究以深入探索兒童H3K27M突變型膠質瘤的分子機制以及有效的靶向治療策略。