卵巢癌液體活檢技術研究進展

王璐，韓世愈

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院婦產科，哈爾濱150001)

卵巢癌是癌癥死亡的第五大常見原因，也是婦科癌癥死亡的最主要原因[1]。通常當腫瘤局限于卵巢時，卵巢癌治愈率達90%，而事實上約75%的卵巢癌[2]在晚期才確診，此時腫瘤早已發生轉移，因而治愈率大大降低[2]。臨床上常見的檢測卵巢癌的方法有腫瘤標志物[如血清癌抗原125(cancer antigen 125，CA125)、人附睪蛋白4]聯合超聲、CT、磁共振成像等影像學檢查，以及近年來應用較多的乳腺癌易感基因1/2(breast cancer susceptibility gene 1/2,BRCA1/2)基因檢測[3]，其中最常用的檢測手段是血清CA125聯合經陰道超聲檢查，但有研究認為兩者聯合對卵巢癌進行早期篩查并不能降低死亡率[4]。截至目前，組織活檢仍是診斷卵巢癌的金標準，但其具有侵襲性，且成本高、耗時長，并有造成腫瘤播散的風險，因此尋找新的、非侵入性的檢查方法以期早期診斷卵巢癌、識別卵巢癌高風險患者、實時監測治療反應以及評估預后是臨床亟待解決的問題。液體活檢是一種非侵入性診斷方法，是檢測血液、尿液等體液中的循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、外泌體及腫瘤相關血小板等循環生物標志物，液體活檢較傳統活檢更加安全、方便。以往認為，卵巢癌的主要轉移途徑是直接蔓延、腹腔種植和淋巴轉移，但現有研究表明血源性轉移是卵巢癌轉移的另一種重要方式[5]。現就卵巢癌液體活檢常用的標志物進行綜述，以期為卵巢癌臨床診療工作提供幫助。

1 液體活檢概述

液體活檢是以血液、唾液、尿液、腦脊液、胸腔積液及腹水等體液為檢測樣本獲取腫瘤相關信息的技術，主要檢測內容包括CTC、ctDNA、腫瘤細胞來源外泌體和腫瘤相關血小板等。液體活檢被定義為一種早期癌癥檢測方法，其中CTC和ctDNA已被美國食品藥品管理局批準用于臨床[6]。組織活檢是臨床診斷癌癥應用最多的檢查方法，盡管其能提供有關腫瘤性質的信息，但單次活檢并不足以描述腫瘤的遺傳異質性，也無法提供腫瘤基因組的全面信息，除對患者有侵入性外，還存在固有風險和潛在并發癥，甚至可能造成腫瘤擴散，因此組織活檢并不適用于腫瘤的早期篩查，而液體活檢不僅能在癥狀出現之前發現癌癥，還能用于制訂癌癥晚期治療決策[7]。液體活檢具有非侵入性、準確性高、取樣風險低、取樣限制少、樣品制備簡便等優勢，并可反映出腫瘤基因組的全部信息[8]，其在卵巢癌的篩查和診斷中有重要作用。

1.1CTC CTC是指因自發或診療操作而從實體腫瘤原發灶或轉移灶脫落至外周循環中，少數仍具有高活性、能逃離機體免疫損傷而存活，并通過血液運行轉移到其他組織器官并形成轉移灶的腫瘤細胞。1998 年，CTC首次從血液中分離并被證實與腫瘤病理分期相關[9]。此后，CTC被越來越多地應用于臨床，并在更多實體上皮癌的遠處轉移灶中發現[10]。CTC的逃逸機制目前尚不明確，但可以肯定的是同一類型癌癥的不同患者，甚至同一患者的癌細胞之間也存在較大的分子和細胞異質性[11]。血液中CTC數量極少，在晚期癌癥患者的血液循環中，每10億個血細胞中才有1個CTC，而液體活檢中CTC檢測除了計數單個CTC評估癌癥外，還能提示CTC的分子表征，包括治療靶點[12]和耐藥機制[13]。CTC的半衰期很短，大約4 h，這一特性決定CTC的檢測結果具有較強的實時反應性，可作為動態監控的一種靶標物，同時這一特性也說明，除了活性CTC，外周血中還能檢測到破碎或凋亡的CTC，這使得CTC的檢測結果存在一定誤差，但只有活性CTC對評價腫瘤轉移有意義[14]。

1.2ctDNA ctDNA是指腫瘤細胞釋放到血液系統中的循環游離DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)。1948年Mandel和Metais[15]首先報道了血液中的cfDNA，1966年在系統性紅斑狼瘡患者中發現了cfDNA的存在[16]，但直到1977年在胰腺癌患者中發現cfDNA水平的升高，cfDNA才進入腫瘤學領域[17]，而從胰腺癌患者血漿樣本中檢測到ctDNA中的KARS基因突變才使人們真正意識到ctDNA作為腫瘤生物標志物的適用性[18]。目前ctDNA是液體活檢中最常用的血源性標志物之一，但由于ctDNA高度碎片化、半衰期短且含量極低等，其檢測技術需要極高的特異性和敏感性[19]。近年來，隨著檢測技術的進步和優化，最終形成了目前最常用的3種ctDNA檢測技術:富集聚合酶鏈反應、數字聚合酶鏈反應和下一代測序技術[20]。

1.3外泌體 外泌體是生理或病理狀態下包括正常細胞/腫瘤細胞等幾乎所有類型細胞經胞吐作用釋放到細胞外的具有脂質雙層膜結構的納米級小囊泡，直徑為40～100 nm[21]。外泌體是各種從正常細胞和腫瘤細胞脫落下來的膜囊泡，幾乎存在于所有體液(血液、尿液、腹水、母乳等)中，尤其是血液，外泌體不僅是細胞間通訊的基本介質，還調節并參與包括癌癥在內的眾多生理和病理過程[22]，且越來越多的研究提示外泌體可促進腫瘤細胞的生長、轉移以及血管生成，介導腫瘤免疫應答[23]，激發化療抗性[24]。外泌體內含有大量細胞來源的分子，包括蛋白質、鞘磷脂、神經節苷脂和其他脂類以及大量核酸物質[如微RNA(microRNA,miRNA/miR)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、信使RNA等]，這些分子在細胞遷移、入侵及蛋白質復合物定位中發揮作用[25]。與CTC相似，外泌體由于攜帶了特異性核酸和蛋白質，在研究中應用多種標志物結合[26]以及反轉錄-聚合酶鏈反應擴增技術檢測RNA[27]作為主要檢測手段。miRNA是一類內源性表達的非編碼單鏈小RNA，長度為19～25個核苷酸，主要通過抑制翻譯或降解靶標信使RNA進而調節相關基因的表達，可作為腫瘤抑制因子或致癌基因參與腫瘤的發生、發展，在卵巢癌的發病中發揮重要作用[28]。外泌體可將miRNA包裹其中，對抗富含RNA酶的血液環境，保護miRNA運輸。lncRNA由200多個核苷酸組成，參與多種關鍵的生物學行為，包括印跡基因組位點、塑造染色體構型、調節酶活性等[29]。有研究表明，lncRNA通過與其他細胞大分子(包括DNA、RNA、蛋白質)相互作用驅動多種重要的癌癥表型[30]。在卵巢癌患者中，miRNA和lncRNA是研究和分析的主要外泌體成分，而磷脂酰絲氨酸、聚糖和糖蛋白等其他生物活性分子也可作為外泌體部分進行評估[31]。由于外泌體具有分離試劑盒可廣泛獲得、存在特異性標志物、循環穩定性以及外泌體核酸與腫瘤核酸的精確表達等優勢，與其他生物標志物相比，外泌體在液體活檢技術中應用前景更廣闊[32]。

2 常用液體活檢技術在卵巢癌中的應用

2.1CTC在卵巢癌中的應用 目前已有多種方法利用CTC與健康循環細胞在物理、生物及功能特征等方面的差異對CTC進行富集、分離和鑒定[33]，其中CellSearch?平臺[34]是美國食品藥品管理局唯一批準的臨床應用的CTC。此外，其他方法雖未獲得臨床批準但也用于包括上皮性卵巢癌在內的多種惡性腫瘤實驗室CTC的檢測[35-37]。Suh等[35]收集87例術前未明確附件包塊性質患者的血液標本行CTC檢測，與其他術前診斷方法(如血清CA125、卵巢癌惡性腫瘤風險算法、惡性腫瘤風險指數、CT或磁共振成像)相比，CTC檢測在發現早期癌癥(Ⅰ期和Ⅱ期)方面更敏感，提示術前CTC檢測不僅在區分附件腫塊良惡性方面具有重要作用，還有助于提高癌癥的早期篩查率。Zhang等[36]收集109例上皮性卵巢癌患者的211份血液樣本，采用免疫磁珠篩選法檢測CTC，并對其中51例患者的153份血液樣本同時行CTC和CA125檢測發現，在90%的初診患者中檢測出CTC，且CTC的數量與分期有關，ⅠA期和ⅠB期患者CTC陽性率遠高于CA125陽性率，提示CTC檢測在診斷早期上皮性卵巢癌方面優于CA125檢測，同時也提示CTC檢測可用于早期上皮性卵巢癌的篩查。Lou等[37]收集49例新診斷為盆腔腫塊女性的全血，比較術后經組織病理學診斷為卵巢癌的患者中CTC的存在情況，結果發現，良性盆腔腫塊患者血液中不存在CTC；診斷為卵巢癌的患者中有17%存在CTC，且存在CTC的卵巢癌患者均處于Ⅲ期或Ⅳ期；其他腫瘤卵巢轉移者中有80%存在CTC，說明與原發卵巢癌相比，CTC在其他癌癥卵巢轉移者中更為普遍，提示可根據CTC的數量和存在與否區分良性疾病、卵巢癌和其他癌癥卵巢轉移。Banys-Paluchowski等[38]選取43例癌癥患者(其中34例卵巢癌、5例輸卵管癌和4例原發性腹膜癌)分別給予標準化療方案治療，并于化療前、化療3個周期及化療6個周期后使用CellSearch?系統行CTC檢測，結果發現，化療后CTC計數迅速下降，提示CTC檢測可用來監測化療前后病情變化以及評估化療療效。但鑒于全身治療期間CTC計數下降迅速，提示CTC可能不能識別出具有特定復發風險的患者，因此CTC檢測鑒別實體腫瘤的潛力還需要進一步研究。

2.2ctDNA在卵巢癌中的應用 ctDNA特異性突變檢測是卵巢癌非常重要的液體活檢方法。體細胞TP53基因突變是高級別漿液性卵巢癌的定義特征，Parkinson等[39]對318例高級別漿液性卵巢癌患者治療前的ctDNA進行分析發現，ctDNA與腫瘤體積呈正相關；對于腹水患者，引流出癌性腹水后，ctDNA與腫瘤體積的相關性增強，化療1個周期后TP53最小等位基因頻率≤60%與較快的腫瘤進展時間相關。以上結果為ctDNA成為高級別漿液性卵巢癌高度特異的早期分子標志物提供了依據，但未來還需要進行更深入研究。Balaji等[40]對包括卵巢癌在內的180例癌癥患者的血漿樣本進行分析發現，手術或組織活檢前患者血漿中ctDNA的水平與總體生存相關，高水平ctDNA與不良生存結局相關。以上研究提示，ctDNA有可能成為癌癥各階段制訂治療決策和管理患者的強大工具。此外，來自約翰霍普金斯大學的研究人員在2018年提出了一種名為CancerSEEK的ctDNA檢測方法，他們利用該方法對1 005例非轉移、特定器官腫瘤患者以及812例無癌癥史的健康者進行單一的血液檢測(16個基因和8個蛋白)，同時評估了8種早期癌癥(卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、食管癌、結直腸癌、肺癌和乳腺癌)患者中ctDNA的情況，結果顯示在8種癌癥中，CancerSEEK檢測的陽性中位數為70%，ctDNA檢測卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌以及食管癌5種癌癥的靈敏度為69%～98%，其中卵巢癌為98%，CancerSEEK檢測的特異度大于99%，812例健康者中有7例檢測為假陽性。由此推測，ctDNA檢測可用于卵巢癌的早期篩查[41]。但該項研究也存在局限性，如僅使用健康者作為對照樣本，在真正的癌癥篩查環境中，一些患者由于患有炎癥或其他疾病，可能會導致假陽性率高于此研究結果，因此該方法距投入臨床應用還有一定距離。ctDNA除應用于卵巢癌的早期篩查外，還能為卵巢癌靶向治療藥物選擇提供依據，推動靶向治療發展。有研究發現，在鉑耐藥或難治性高級別漿液性卵巢癌中檢測到BRCA回復突變，而BRCA回復突變與多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶抑制劑治療效果降低有關[42]。ctDNA作為一種非侵入性檢測方法可以及時有效地檢測到BRCA回復突變，從而預測多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶抑制劑耐藥，并有可能提供有關腫瘤異質性的信息。

2.3外泌體在卵巢癌中的應用 Sherman-Samis等[43]在卵巢癌患者的滲出液中成功檢測到含有Nanog蛋白的外泌體，含有Nanog蛋白的外泌體可增強卵巢癌細胞的侵襲、遷移，并提高基質金屬蛋白酶9的活性。Wang等[44]發現，卵巢癌來源的外泌體miR-205能促進卵巢癌細胞增殖，抑制凋亡，并加速癌細胞的遷移和侵襲。腫瘤血管生成是腫瘤侵襲性的重要特征，其能促進腫瘤細胞增殖、侵襲以及轉移。有研究表明，外泌體miR-205可通過誘導腫瘤血管生成促進卵巢癌轉移[45]。近年來，有研究報道了卵巢癌患者血液樣本中的lncRNA(如貓白血病病毒C亞類受體1反義RNA1[46]、用于激酶活化的長基因間非編碼RNA[47]、反義缺氧誘導因子[48])參與了卵巢癌的發生和進展，通過檢測癌癥相關基因可調節卵巢癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲，其中一些有可能成為卵巢癌診斷和預測預后的生物標志物或治療靶標。Qiu等[49]發現，上皮性卵巢癌循環外泌體中屬于lncRNA的人類肺腺癌轉移相關轉錄本1可促進血管生成，其水平也與患者預后相關。另一項研究證明，卵巢癌細胞分泌的細胞外囊泡中的miR-141-3p可促進內皮細胞遷移和血管生成[50]。Cao等[51]研究表明，外泌體中的DNA甲基轉移酶1可使宿主卵巢癌細胞對順鉑產生耐藥性。Kanlikilicer等[52]發現，在卵巢癌來源的外泌體中表達的miR-1246通過影響M2型巨噬細胞，介導卵巢癌中紫杉醇耐藥。但并非所有外泌體均能起到促進作用，有研究表明，外泌體miR-6126是一種腫瘤抑制因子，可降低體外卵巢癌細胞的侵襲性[53]。此外，外泌體中屬于跨膜糖蛋白的去整合素金屬蛋白酶15也起著腫瘤抑制劑的作用[54]。

以上來源于卵巢癌的外泌體對于卵巢癌的早期診斷具有較高的參考價值，但這些生物標志物進入臨床前還需進一步驗證。

2.4腫瘤相關血小板在卵巢癌中的應用 血小板是起源于骨髓的循環無核細胞碎片，在止血和傷口愈合中起著至關重要的作用。近年來發現血小板在腫瘤發生發展中發揮作用，在腫瘤生長過程中，血小板與腫瘤細胞相互作用后，導致的與腫瘤相關的生物分子轉移和血小板激活可誘導前信使RNA的特異性拼接，該剪接事件還依賴于腫瘤、基質細胞和免疫細胞的刺激[55]。因此，腫瘤特異性剪接的前信使RNA和攝取的生物分子(包括血小板中的信使RNA)具有診斷癌癥的潛在價值[55]。Cho等[56]發現，將血小板輸注到患有卵巢原位癌的小鼠體內可增加腫瘤細胞的增殖指數，表明血小板對腫瘤細胞有促增殖作用。研究發現，與血小板計數正常的卵巢癌患者相比，伴有血小板增多癥的卵巢癌患者的腫瘤細胞增殖指數更高，表明血小板在體內外均可促進卵巢癌細胞增殖，這拓展了對血小板促進腫瘤進展機制的理解。Best等[57]從健康個體中檢測出腫瘤相關血小板，其區分惡性、轉移性腫瘤患者的準確度為96%，分析其RNA圖譜變化，成功定位原發腫瘤，準確度為71%，提示腫瘤相關血小板中存在顯著的腫瘤類型特異性剪接。以上研究表明，血小板增多、腫瘤相關血小板及RNA譜都可能成為癌癥篩查、診斷、預后以及治療監測的有效生物標志物。目前關于腫瘤相關血小板在卵巢癌中適用性的評估尚處于起步階段，需要進一步的臨床試驗來驗證卵巢癌與這些特征之間的相關性。

3 小 結

盡管對卵巢癌進行了廣泛的研究，但缺乏特異的診斷和預后評估方面的生物標志物是導致卵巢癌患者生存率低下的原因之一。液體活檢是臨床腫瘤學的一項突破性技術，在篩查和診斷卵巢癌方面有巨大潛力，但將其應用于臨床前還存在以下問題:①技術限制，如分離和定量過程的標準化、分析前后的質量控制以及基礎分析的驗證；②確定生物標志物和潛在的質量標準后，其臨床意義(對早期發現、治療效果和生存率的影響)必須在更大樣本量中驗證。通過不斷克服應用限制，液體活檢技術在卵巢癌的篩查、診斷及預后評估等方面的應用前景將更加廣闊。