船盔烏頭快速繁殖技術研究初探*

央金拉姆 尼珍

（西藏自治區高原生物研究所，西藏 拉薩 850000）

船盔烏頭(Aconitum naviculare(Bruhl.)Stapf）又名船形烏頭、其藏藥名為“榜嘎”，屬于毛茛科烏頭屬的矮小草本植物，塊根小，胡蘿卜形，莖高10～45 厘米，下部無毛，上部疏被反曲并貼伏的短柔毛。基葉及下部莖生葉具長柄；葉片半圓狀五角形或腎形，長1～2厘米，寬1.4～3 厘米，基部心形或截形，3 裂近中部，表面疏被短柔毛，背面無毛，葉柄長2.5～14 厘米，無毛。莖生葉1～3，漸變小。總狀花序具2～4 花；軸及花梗被反曲的短柔毛；花梗長達6厘米；小苞片生花梗莖頂部處，線形，長6～7 毫米；萼片堇色，外面疏被短柔毛，上萼片船形，自基部至喙長約1.6 厘米，側萼片寬倒卵形，長約1.6 厘米；花瓣無毛，瓣片長約2.5 毫米，唇長約1.5 毫米，距長約1 毫米，向外彎；心皮5，子房疏被短柔毛。9月開花。性味苦，寒，有小毒。生于高山碎石縫隙和高山草甸，灌叢中、或河灘上，海拔4100～5000 米。產于拉薩、朗縣、加查、乃東（澤當）、墨竹工卡（格桑）、錯那、亞東（帕里）。其塊根狀如小象犬牙，葉翠綠，螺狀，有清熱解毒利濕的功效，能治胃炎、肝炎、腎炎、腸炎。［1］

《概念釋詮》中說：“榜嘎生長在陰涼的石山坡，螺形根如象牙，葉如玉葉，螺狀花很美麗，為解毒清膽熱之后藥。”《圖鑒》中說：“榜嘎分白、黑、紅、黃四種，白、紅、黃三種是藥，黑烏頭有毒亦可入藥。”據《晶珠本草》記載“船盔烏頭味苦，性涼。清熱解毒。治瘟病時疫、赤巴病、傳染病發燒、肝膽熱病，特別是膽熱病和宿熱病療效尤佳，食物中毒、胃炎、肝炎。外用洗蛇、蝎咬傷。其主要化學成分有二萜生物堿，經鑒定有C20二萜生物堿阿替辛及C19內酯型二萜生物堿雜阿替辛及苯甲酰雜阿替辛。船盔烏頭中含有的生物堿阿替辛對貓、兔及狗具有降壓作用，小劑量能加強腎上腺素的升壓作用但減少心動徐緩。異阿替辛則有降壓及阻礙呼吸的作用，并能對抗由于烏頭堿或氯化鈣所導致的心律不齊的作用。船盔頭的塊根對小鼠的LD50（靜注）為2.374mg/kg，而船盔烏頭中所含主要生物堿之一雜阿替辛對小鼠LD50(靜注)為180～190g/kg，因而船盔烏頭在烏頭類中屬于毒性較低的一類。”

2015 年由西藏自治區科技廳組織的根據我區藏醫藥專家、植物學家、各企業等對我區瀕危藏藥材品種的選定進行收集和整理后，評選出西藏瀕危藏藥材品種，劃分為三個保護等級，其中，船盔烏頭列入一級瀕危名錄。

1 船盔烏頭組培快繁技術研究背景

組培快繁技術是根據細胞的全能性理論，也稱離體培養，是指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞，原生質體等，通過無菌操作，在無菌條件下接種至含有各種營養物質及植物激素的培養基上進行培養，來獲得再生的完整植株技術。有研究表明，西藏地區藏藥“榜嘎”的實際基原是船盔烏頭的干燥全草或地上部分，據自治區藏藥廠提供的資料，約30%的藏藥組方中都有船盔烏頭的組分，安兒寧顆粒、大月晶丸、坐珠達西、流感丸、十三味榜嘎丸、十二味奇效湯散、八味獐牙菜、二十五味松石丸和亞瑪眾清制劑等藏藥當中都含有船盔烏頭。［2］目前船盔烏頭的供給主要是靠野生資源，但是市場上對船盔烏頭的需求量日不斷增多，但自然狀態下船盔烏頭分布零星，單株產量低下，自然生長趕不上人為采集，采集量的增大不僅破壞種群的自然更新，也破壞了船盔烏頭的生境，使得船盔烏頭的資源趨于瀕危狀態，已經在一定程度上影響到藏醫藥事業的健康發展。因此,研究船盔烏頭的組培快繁技術迫在眉睫。［3］

2 船盔烏頭組織培養研究現狀

目前，有關一級瀕危藏藥植物船盔烏頭的研究，涉及資源與使用情況、種子萌發特性研究、染色體數目和核型分析、化學成分分離及其薄層色譜定性鑒別研究、生物堿成分分離及質量標準研究、總生物堿的抗炎作用等領域，但涉及本研究特點的一級瀕危藏藥植物船盔烏頭的組織培養快速繁殖研究尚屬空白，因此，通過本研究進行一級藏藥植物船盔烏頭的快速繁殖研究，從而能夠緩解船盔烏頭野生資源匱乏、用藥資源緊缺的壓力。

3 無菌苗的獲取

3.1 外植體的選取和處理

本實驗選擇2019 年拉薩周邊采集的船盔烏頭植株作為實驗材料，分別用船盔烏頭的種子、船盔烏頭的根、船盔烏頭的莖段和船盔烏頭的葉片四種組織作為外植體。

外植體材料的消毒滅菌處理，是植物組培實驗過程中的關鍵一步，影響愈傷組織的褐化率或誘導率，進而影響組培苗的存活率。

船盔烏頭干種子黑褐色，呈“扁金字塔”形，長1.5～2.2mm，寬0.6～1.1mm，厚可達0.8mm。種子表面不光滑，皺縮，種脊邊緣延生成翅狀。船盔烏頭種子千粒重為（0.495±0.003）g，屬于極小粒種子。首先用肥皂水將種子清洗干凈，后用酒精對種子進行消毒，最后在超凈工作臺上以0.1% HgCL 溶液設置消毒處理時間梯度，再用無菌水清洗4～5 次，瀝干水分備用。

船盔烏頭的葉片腎狀五角形或腎形，長1～2 厘米，寬1.4～3厘米，三裂近中部，中央裂片菱狀倒梯形，側裂片斜扇形，不等二裂近中部，表面疏被短柔毛，背面無毛；葉柄長2.5～14 厘米，無毛，基部具不明顯的鞘。莖生葉1～3 枚，稀疏排列，具較短柄。選擇較嫩的葉片，剪成兩片，先用水清洗干凈，再用酒精進行消毒，后用0.1% HgCL 溶液設置消毒處理時間梯度，再用無菌水清洗4～5 次，瀝干水分。

船盔烏頭的莖段下部無毛，上部疏被反曲而緊貼的短柔毛，呈圓柱形空心，取嫩枝上的莖段，用肥皂水進行清洗，再用酒精進行消毒，以0.1% HgCL 溶液進行消毒處理，設置消毒處理時間梯度，再用無菌水清洗4～5次，瀝干水分備用。

3.2 外植體啟動培養

已經消毒處理過的三種外植體（種子、莖段、葉片）在超凈工作臺上分別接種至初始培養基上，初始培養基為MS+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5g/L，PH 值5.8。培養基是植物組織快繁過程中最主要的部分，是植物組織生長發育的主要營養來源。接種后在智能人工氣候培養箱內暗培養14d后，三種外植體中只有消毒時間為8 min 和10 min的種子開始發芽，再移至培養室光照條件下培養20d，培養溫度為20±2℃。即可長出小苗，再培養20d 無菌小苗可長至約4cm 高，莖段和葉片作為外植體啟動培養都未發芽成功。此處，對三種外植體的消毒處理，都是用酒精和0.1% HgCL 進行消毒處理。

表1 0.1% HgCL不同處理時長萌發情況對比

4 分化及生根培養

4.1 船盔烏頭分化培養

分化培養是促進細胞發育成各自的組織。將初始培養得到的船盔烏頭無菌苗剪切成節段，分別接種到以下9種不同的培養基當中：

（1）1/2MS+6-BA10mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（2）1/2MS+6-BA15mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（3）1/2MS+6-BA20mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（4）1/2MS+IAA0.05mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（5）1/2MS+IAA0.1mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（6）1/2MS+IAA0.15mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（7）1/2MS+NAA0.05mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8;

（8）1/2MS+NAA0.1mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8。

（9）1/2MS+NAA0.15mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8。

在培養室的光照條件下培養至20d，能觀察到3號分化培養基里的船盔烏頭無菌苗存活率和長勢都優于其余8種分化培養基。

表2 不同分化培養基對比

4.2 船盔烏頭生根培養

生根培養是使無根苗生根的過程，這個過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。將分化培養得到的無菌苗分別接種到以下10種不同的培養基當中：

（1）MS+蔗糖30g/L+瓊脂粉5g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（2）1/2MS+6-BA5mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1 g/L，PH值5.8；

（3）1/2MS+6-BA7mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1 g/L，PH值5.8；

（4）1/2MS+6-BA9mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1 g/L，PH值5.8；

（5）1/2MS+NAA0.5mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（6）1/2MS+NAA1mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（7）1/2MS+NAA1.5mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（8）1/2MS+IAA0.5mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（9）1/2 MS+IAA1mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8；

（10）1/2 MS+IAA1.5mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH值5.8。

接種時將帶腋芽節段斜插在培養基上，接種后放在人工智能培養箱內進行培養。培養箱的環境設置模擬船盔烏頭的野外生長環境，即白天、夜晚兩個時段，白天12 小時，溫度20℃，光照強度1000～1500Lx；夜晚12 小時，溫度10℃，無光照，在此培養箱內培養20d 左右可以發現有明顯的根部粗壯現象，相比之下10 種培養基當中1 號生根培養基和2 號生根培養基的長勢最好。

表3 不同生根培養基對比

5 結果與分析

5.1 本次船盔烏頭組織培養啟動實驗通過酒精和0.1%HgCL 對所選外植體進行消毒處理，利用初始培養基MS+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉5g/L，PH值5.8，在人工氣候培養箱里進行暗培養，結果只有種子作為外植體時萌發成功，莖段和葉片作為外植體進行啟動試驗時并未成功萌發，因此，種子作為外植體比較方便消毒，成功獲得無菌苗。

5.2 船盔烏頭的組織培養分化培養過程中，通過添加不同濃度的細胞生長素和細胞分裂素的MS 培養基，研究對船盔烏頭初始無菌苗形成的影響，表明培養基1/2MS+6-BA 20mL/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L+肌醇0.1g/L,PH5.8適合于船盔烏頭初始無菌苗的分化。

5.3 船盔烏頭組織培養生根培養過程中，通過添加不同濃度的細胞生長素和細胞分裂素的MS 培養基，研究對船盔烏頭已經分化的組培苗形成的影響，結果表明培養基MS+蔗糖30 g/L+瓊脂粉5g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1g/L，PH 值5.8 和1/2MS+6-BA 5mL/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉6g/L+活性炭0.25g/L+肌醇0.1 g/L，PH值5.8，最適合船盔烏頭的生根培養。