響應面法優化余甘子果渣沒食子酸的提取工藝

孟曉，唐鳴躍，袁昌益，劉秋妍，王娟，蔣麗施

成都中醫藥大學公共衛生學院（成都 611137）

余甘子，為大戟科葉下珠屬植物余甘子（Phyllanthus emblicaL.）的果實，主要生長于亞洲的熱帶或亞熱帶地區，具有清熱涼血、消食健胃、生津止咳的功效[1-2]，也是具有特色的藥食同源品種與經濟作物。現代大量研究證明，余甘子具有大量的多酚、黃酮、超氧化物歧化酶（SOD）等活性成分，并具有預防腫瘤、降血脂、降血糖、抗菌消炎及其他多種人體特殊的生理功能[3-5]。余甘子中的主要藥用生理活性物質成分中又以沒食子酸含量居多，研究已證明沒食子酸確實具有天然抗菌抗炎、抗氧化、抗腫瘤等特殊功能作用[6-8]，被廣泛應用于各種藥品、保健品、食品、食品添加劑生產等行業[9-10]。

提取沒食子酸常見的方法有離子萃取法、回流法、浸漬法、酸堿水解法等[11-13]。其中：回流法、浸漬法的提取時間一般較長，且生產成本較高；離子萃取法生產成本低，但溫度較高，對產物的活性有影響；酸水解法、堿水解法可得到大量沒食子酸，提取率高，但二者提取工藝復雜，工業化生產成本較高；與其他方法相比，水提法使用的設備成本低、操作簡便、安全系數高、適應工業化生產[11]。

以余甘子果渣對研究對象，采用水提法，通過單因素試驗和響應面試驗設計，優化余甘子果渣沒食子酸提取的最佳工藝條件，為余甘子及其副產物的綜合開發利用提供一定技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮余甘子（市售）；沒食子酸標準品（中國食品藥品檢定研究院）；福林酚、無水碳酸鈉（分析純）。

1.2 儀器與設備

JD300-3分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）；L2S可見光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；HH-6數顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DHG-9240 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海瑯玕實驗設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取工藝

新鮮余甘子榨汁→過濾后得濾渣→稱取果渣移入錐形瓶中→加入蒸餾水→水浴鍋浸提→抽濾→濾液回收→蒸餾水定容→以蒸餾水為參比液測吸光度

1.3.2 沒食子酸的測定

1.3.2.1 沒食子酸標準曲線的制作

稱取25 mg沒食子酸標準品，用蒸餾水溶化，定容至250 mL容量瓶中，調配成質量濃度0.1 mg/mL的標準品溶液。用移液管依次吸取0，1，2，3，4和5 mL標準溶液于50 mL棕色容量瓶中，分別加入1 ml福林酚混合，靜置5 min，再分別加入2 mL的15%碳酸鈉溶液，充分混合后定容，配成終質量濃度依次為0.002，0.004，0.006，0.008和0.010 mg/mL的對照品溶液，以空白樣做參比，并于760 nm測其吸光度，反復測量3次，參照式（1）進行計算[14]。

1.3.2.2 沒食子酸提取率的計算

式中：A0為樣品吸光度；V為樣品濾液定容后的體積，mL；m為樣品的質量，g；Q為稀釋倍數。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 提取時間對提取率的影響

在提取溫度80 ℃、料液比1∶30（g/mL）、提取2次條件下，研究不同提取時間（30，40，50，60和70 min）對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響。

1.3.3.2 提取溫度對提取率的影響

在提取時間60 min、料液比1∶30（g/mL）、提取2次條件下，研究不同提取溫度（60，70，80，90和100 ℃）對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響。

1.3.3.3 料液比對提取率的影響

在提取溫度80 ℃、提取時間60 min、提取2次條件下，研究不同料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70 g/mL）對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響。

1.3.3.4 提取次數對提取率的影響

在提取溫度80 ℃、料液比1∶30（g/mL）、提取時間60 min條件下，研究不同提取次數（1，2，3，4和5次）對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響。

1.3.4 響應面優化

在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 12.0軟件進行Box-Behnken試驗設計。以提取溫度、提取時間及料液比為考察對象，以沒食子酸提取率為指標進行試驗設計，其因素水平見表1。

表1 響應面試驗因子水平

1.4 數據處理與統計分析

從余甘子果渣中提取沒食子酸的單因素試驗重復3次，取平均值。使用 Microsoft Office Excel 2013處理試驗數據。采用SPSS 25.0和Design-Expert 12.0數據處理系統進行統計分析。其中，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

由圖1可以得到，以吸光度為縱坐標，以標準品質量濃度為橫坐標，對其做線性回歸得出標準曲線方程y=109.97x+0.006 8，相關系數為R2=0.999 2，表明在0.000～0.010 mg/mL的范圍內，線性關系良好。

圖1 沒食子酸標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同提取次數對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響

從圖2可知，提取次數從1次增加到2次，余甘子果渣沒食子酸的提取率明顯升高，提取次數為2次時，與提取1次相比余甘子果渣沒食子酸提取率有顯著差異（P＜0.05），為3.49%±0.20%，但是提取2次后提取次數的增加對沒食子酸提取率無顯著影響（P＞0.05），說明余甘子果渣中的沒食子酸2次基本提取完畢，考慮到成本、耗時等綜合因素，確定余甘子果渣沒食子酸的最佳提取次數為2次。

圖2 提取次數對沒食子酸提取率的影響

2.2.2 不同提取時間對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響

從圖3可知，隨著提取時間從30 min延長到60 min，余甘子果渣的沒食子酸提取率逐漸增加。提取時間為60 min時，與提取時間50 min時相比，其提取率顯著升高（P＜0.05），為3.18%±0.03%。但是，60 min后，繼續延長提取時間，余甘子果渣的沒食子酸提取率出現顯著下降趨勢（P＜0.05）。原因可能是提取時間過短時沒食子酸未能充分溶出，隨著提取時間的延長，沒食子酸溶解充分，提取率升高。60 min之后提取時間進一步增加，沒食子酸結構可能被分解破壞，造成提取率降低[15]。因此，余甘子果渣沒食子酸的最佳提取時間為60 min。

圖3 提取時間對沒食子酸提取率的影響

2.2.3 不同提取溫度對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響

從圖4可知，提取溫度在60 ℃時沒食子酸提取率最低，隨著提取溫度逐漸增加，沒食子酸提取率不斷升高，提取溫度在90 ℃時沒食子酸提取率達到最大。余甘子主要含多酚類物質，其中可水解鞣質能夠受酸、堿等催化而水解，加熱過程中，由于多酚等物質的作用，提取物處于酸性狀態，連續加熱后發生水解反應，從而生成沒食子酸使得沒食子酸含量上升，提取率增高[15]。因此，余甘子果渣沒食子酸的最佳提取溫度為90 ℃。

圖4 提取溫度對沒食子酸提取率的影響

2.2.4 不同料液比對余甘子果渣沒食子酸提取率的影響

從圖5可知，料液比從1∶20（g/mL）變化到1∶50（g/mL），余甘子果渣的沒食子酸提取率由下降轉為逐漸增加，料液比1∶50（g/mL）時，與料液比1∶60（g/mL）相比提取率有顯著差異（P＜0.05），該條件下余甘子果渣的沒食子酸提取率最高，為3.78%±0.05%。原因可能是隨著液體占比的增大，沒食子酸溶出，當液體占比過大時，溶劑過多，沒食子酸的溶出已達極限，其他物質溶解增多，沒食子酸提取率降低[16]。因此，余甘子果渣沒食子酸的最佳提取料液比為1∶50（g/mL）。

圖5 料液比對沒食子酸提取率的影響

2.3 響應面試驗

基于單因素試驗結果，根據Box-Behnken中心組合設計三因素三水平的響應面分析試驗。根據表1中的因素和水平設計試驗方案。響應面的試驗設計和結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計和結果

將表2中的數據運用Design Expert軟件做回歸擬合，得到以余甘子果渣沒食子酸提取率（Y）為響應值的目標函數：Y=3.84+0.096 3A-0.031 2B+0.100C+0.030 0AB+0.017 5AC-0.002 5BC-0.277 0A2-0.082 0B2-0.029 5C2。

回歸模型方差分析見表3。利用方差分析結果建立的回歸模型P＜0.000 1，達到極顯著水平，得出R2=0.986 7，Radj2=0.969 7，結果表明，該模型可以較好地反映響應值的變化。失擬項（P=0.705 5）不顯著，表明回歸模型和預測值之間有較好的擬合度。

表3 回歸模型方差分析

通過料液比、提取時間、提取溫度的試驗設計優化，得到相應的數據分析。二次方程回歸系數的顯著性表明，因素A提取溫度（P＜0.010）對余甘子果渣沒食子酸提取影響極顯著，因素B提取時間（P＜0.050）對余甘子果渣沒食子酸提取影響顯著；交互項對余甘子果渣沒食子酸提取影響均不顯著；二次項A2、B2（P＜0.010）對余甘子果渣沒食子酸提取影響極顯著。各因素對從余甘子果渣中提取沒食子酸的影響順序：提取溫度二次項=提取溫度一次項＞提取時間二次項＞提取時間一次項＞料液比二次項＞提取時間和提取溫度交互項＞料液比和提取溫度交互項＞料液比一次項＞料液比和提取時間交互項。

圖7 提取溫度和料液比對沒食子酸提取率影響的響應面及等高線

根據回歸模型作出相應的響應面及等高線，從各個因素交互作用對響應面進行分析，從圖6～圖8可知，提取溫度與提取時間的交互作用對余甘子果渣沒食子酸提取的影響最顯著。

圖6 提取溫度和提取時間對沒食子酸提取率影響的響應面及等高線

圖8 提取時間和料液比對沒食子酸提取率影響的響應面及等高線

2.4 最佳工藝條件試驗驗證

為驗證回歸模型的預測值與試驗的真實值之間的擬合程度，采用余甘子果渣沒食子酸的提取率驗證響應因素。考慮到試驗的可操作性，選擇響應因子：提取溫度91 ℃、提取時間59 min、料液比1∶51（g/mL）。在該條件下進行3組平行試驗，沒食子酸平均提取率為3.84%，與回歸模型預測值（3.86%）相比，相對誤差小于0.01%。因此，通過響應面法優化得到的余甘子果渣沒食子酸最佳提取工藝條件的回歸模型符合實際。

3 結論

以余甘子果渣為研究對象，采用水提法提取余甘子果渣中的沒食子酸，通過單因素試驗和響應面優化試驗進行分析研究，得出最優提取條件：提取2次、提取溫度91 ℃、提取時間59 min、料液比1∶51（g/mL）。在該條件下，余甘子果渣沒食子酸的提取率可達3.84%±0.01%。試驗結果可為余甘子果渣沒食子酸提取工藝的工業化應用提供參數借鑒。

4 討論

國內外研究主要集中在余甘子提取物的生理活性、藥理作用等方面[17-18]，對余甘子沒食子酸的提取大多采用超聲、回流、離子萃取法等，采用水提法對余甘子果渣中沒食子酸的提取研究較少。

水提法是傳統的提取方法，唐遠江等[19]在加33.5倍水、90 ℃下回流提取4.2 h、提取2次的條件下提取地榆中的沒食子酸，經真空濃縮后，其提取率可達4.21%，試驗的提取溫度與其研究的提取溫度基本一致，90 ℃的高溫有利于沒食子酸的溶解，但其提取時間更長，有利于一系列水解反應生成更多的沒食子酸，而試驗提取工藝較簡單，提取時間較短，余甘子中的單寧酸類物質未完全轉化成沒食子酸。吳春燕[20]采用離子萃取法，從芒果葉中提取沒食子酸，在提取溫度100 ℃、NaHCO3濃度0.16%、溶劑倍量90 mL/g、浸提60 min條件下，沒食子酸的提取率為1.74%；趙仕花等[21]使用超聲輔助提取芒果皮中的沒食子酸，在超聲頻率20 kHz、超聲波輸出功率350 W、乙醇體積分數30%、浸提時間70 min、浸提溫度50 ℃及料液比1∶40（g/mL）的條件下，沒食子酸提取率為2.42%。離子萃取法和超聲輔助提取法均利于有效成分的析出，減少浸提時間，也增加產物的提取率，但對芒果廢棄物中沒食子酸的提取來說，提取效率并不高，且二者研究的提取率均不及試驗的提取率高，這或許與試驗研究的對象差異有關。研究表明，芒果葉中沒食子酸含量為0.23%[22]，芒果核仁中沒食子酸含量為2.45%[23]，相比芒果廢棄物中的沒食子酸而言，余甘子果渣中沒食子酸的含量更高，余甘子大部分有效成分主要集中在果肉，果核中脂肪酸類成分占比較高[24]，但仍含有一定量的鞣質、酚酸等功能性成分。試驗操作更簡便，材料易得，效率更高。

與酸、堿水解等其他提取沒食子酸的方法相比，得到的沒食子酸提取率較低，但試驗采用水提法提取余甘子果渣中的沒食子酸，以水為溶劑，廉價易得，使用安全，沒有化學污染，得到的沒食子酸在安全性上有保障，可用于食品、藥品、化妝品和食品添加劑等行業。另外，余甘子果渣作為廢棄物，極易發生褐變反應。余甘子酶促褐變以沒食子酸為底物，經多酚氧化酶等酶氧化，形成褐變物質[25]。隨著果渣貯存時間的變化，沒食子酸提取率也有明顯變化，因此，在實際工業生產中可進一步優化果渣的貯存條件，以提高沒食子酸提取率。