海洋源復合多肽固體飲料的研制及其活性評價

肖盼盼，張豪，古敏晴，李飛飛，王新文，李文保

1.深圳市華大海洋生物醫藥技術研究院（深圳 518000）；2.深圳華大海洋科技有限公司（深圳 518000）

據世界衛生組織統計，全球共有約1.86億人患不孕不育癥。造成不孕不育的其中一個原因是男性性功能障礙[1]。據統計，1995年全球男性性功能障礙患病人數為1.52億，預計2025年患病人數將達到3.22億[2]。我國一項調查發現40～49，50～59和60～69歲的男性，患病率分別達55.3%，88.2%和91.8%[3]。然現有治療藥物，常伴有副反應[4]。

疲勞是亞健康的主要癥狀之一[5]，影響著全球超過30%的人口[6-7]。疲勞常通過藥物及營養補充來緩解[8]，但服用藥物，可能會引發一些不良反應[9]。營養補充產品可能含有興奮劑，不適用于所有群體[10]。因此，開發一款安全有效的食源性功能產品，對患者進行營養干預，有助于改善男性性功能障礙及疲勞狀態。

海洋是開發功能性食品的重要資源[11]。牡蠣，具有豐富的營養價值和藥用價值，具有增強男性性功能、抗疲勞的功效[12-14]。海參是世界八大珍品之一，具有抗疲勞、提高免疫力、抗癌等生物活性[15]。我國鰻魚的養殖規模和加工產量占全球60%以上[16]，《日華子本草》記載：鰻魚可起陽、治勞，補不足[17]。

以海洋源牡蠣肽、海參肽、鰻魚肽為原料，利用動物試驗，研究三者不同配比對提高男性性功能及疲勞的調節作用，從而明確海洋源復合多肽固體飲料中主要功能成分及最佳配比。在此基礎上，以VC、糖醇、速溶咖啡粉為輔料，以感官評價為指標，通過單因素試驗及正交試驗，確定產品最佳配方，旨在得到一款具有增強男性性功能及抗疲勞活性，兼具獨特風味及口感的新型固體飲料，以期為男性性功能障礙患者及疲勞人群提供一種安全無后顧之憂的新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣肽、海參肽（山西原生肽科技有限公司）；鰻魚肽（德州藍力生物技術有限公司）；糖醇（山東福田藥業有限公司）；速溶咖啡粉（德宏后谷咖啡有限公司）；競品1和2（購自網絡購物平臺）；苯甲酸雌二醇、黃體酮[上海全宇生物科技（駐馬店）動物藥業有限公司]。

1.2 儀器與設備

HC200C槽型混合機（寶雞建華制藥機械有限公司）；國家統一標準篩（上虞市道墟五四儀器廠）；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；AUW120D型電子天平[島津企業管理（中國）有限公司]；Varioskan LUX全波長酶標儀（美國賽默飛世爾科技）；XR-XM101游泳箱（上海欣軟信息科技有限公司）。

1.3 試驗動物

ICR雄性小鼠195只，雌性小鼠325只（18～22 g），由遼寧長生生物技術股份有限公司提供。SPF級動物房，溫度25±2 ℃，濕度40%～70%，明暗交替時間為12 h/12 h。

1.4 試驗方法

1.4.1 工藝流程

原料篩選→粉碎過篩→稱料→混合調配→填充→包裝→熱收縮→金屬探測→成品

1.4.2 主原料及原料配比篩選

1.4.2.1 抗氧化活性檢測

參考張瑞剛等[18]、曹明原等[19]的方法檢測牡蠣肽、海參肽及鰻魚肽的抗氧化活性。

1.4.2.2 性功能活性檢測

雄鼠適應性喂養7 d后隨機分組（表1），每組10只，受試樣品經口灌胃，給予4周。雌鼠于試驗結束前2周進入動物房，隨機分組，每組20只，于試驗結束前2 d連續腹腔注射苯甲酸雌二醇（每只20 μg），觀察前4 h腹腔注射黃體酮（每只500 μg），使之進入動情期。末次給藥后，于當晚20：00～23：00，在安靜、弱光的室內將雄鼠分別單獨放入籠中，適應環境10 min，每只雄鼠投入2只雌鼠，攝錄20 min內小鼠的交配行為[20]。統計各組小鼠的性行為指標，包括捕捉潛伏期（投入雌鼠與雄鼠第1次捕捉雌鼠的時間間隔）、捕捉次數（雄鼠捕捉雌鼠的次數）、射精潛伏期（投入雌鼠與雄鼠第1次射精的時間間隔）、射精次數（雄鼠射精的次數）[21]。

1.4.2.3 抗疲勞活性檢測

試驗動物適應性喂養7 d后隨機分組（表1），每組10只，受試樣品經口灌胃，給予6周。末次給予受試樣品30 min后，將尾根部負荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深不少于20 cm，水溫22±2 ℃，記錄小鼠自游泳開始至力竭的時間，即小鼠負重游泳時間[22]。

表1 動物試驗方案

1.4.3 優化試驗

1.4.3.1 單因素試驗

在主成分及配比確定的前提下，以感官評分為評價指標，通過單因素試驗分別探究VC添加量（0.10%，0.15%，0.20%，0.25%和0.30%）、糖醇添加量（50%，55%，60%，65%和70%）及速溶咖啡粉添加量（2.5%，5.0%，7.5%，10.0%和12.5%）對固體飲料品質的影響?？疾靻我蛩貢r，其他指標以中間值為固定的參數條件。

1.4.3.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以VC、糖醇及速溶咖啡粉的添加量為自變量，以感官評分為指標，進行L9(33)正交試驗。通過正交試驗及方差分析優化固體飲料配方，正交組合設計見表2。

表2 正交試驗設計因素水平表 單位：%

1.4.4 感官評價指標

參考唐森等[23]、王帥等[24]的方法對產品進行感官評定，感官品質綜合評價標準見表3。

表3 感官評分標準表

1.4.5 產品活性檢測

待產品配方確定后，對其進行性功能及抗疲勞活性檢測。

1.4.6 營養及質量檢測

按照GB 7101—2015《食品安全國家標準 飲料》、GB/T 29602—2013《固體飲料》及GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》的要求，對產品進行營養及質量檢測。

1.4.7 數據處理

采用SPSS 18.0軟件進行數據統計分析，組間比較采用雙尾t-檢驗，其中P＜0.05代表有顯著性差異，P＜0.01代表有極顯著性差異。選用GraphPad Prism 6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 主原料及原料配比篩選

2.1.1 主原料抗氧化活性檢測

據報道，抗氧化物質可消除過度生成的自由基，改善精子活力和活性[25]，可與內源性自由基相互作用，減少機體氧化損傷，減少疲勞產生[11]。研究發現（表4），鰻魚肽、牡蠣肽及海參肽均具有抗氧化活性，相較，牡蠣肽活性最強。因此，篩選牡蠣肽為必備功效成分，復配鰻魚肽和（或）海參肽，進行體內動物試驗，以確定產品功效成分及最佳配比。

表4 抗氧化活性檢測結果統計

2.1.2 主原料性功能活性檢測

性功能檢測指標中，捕捉潛伏期及射精潛伏期越短，捕捉次數及射精次數越多則其活性越好[21]。分析發現（圖1）：與CT組相比，P2、P4、P5、P7、P8和P9組的捕捉潛伏期顯著縮短，捕捉次數顯著增加；P4組射精潛伏期顯著縮短，射精次數顯著增加；P5、P6、P7和P8組的射精次數顯著增加。綜合發現，P4組各指標均顯著改善，具有最強的性功能增強活性。

圖1 性功能活性檢測結果圖

2.1.3 主原料抗疲勞活性檢測

運動耐力的提高是抗疲勞最有力的表現，負重游泳時間越長則抗疲勞活性越強[22]。由圖2可知，與CT組相比，P1、P3、P4、P5和P6組負重游泳時間顯著延長（P＜0.05），具有抗疲勞活性，其中P4組負重游泳時間由528.5 s提高至786.4 s，延長48.8%。

圖2 抗疲勞活性檢測結果

2.2 配方優化——單因素試驗

結合性功能及抗疲勞活性檢測結果，確定產品功效成分為牡蠣肽及海參肽，添加比例為10∶1（g/g）。在此基礎上，以感官評價為指標確定（VC）、糖醇及速溶咖啡粉的添加量。

2.2.1 VC添加量的確定

VC是多細胞生物必不可少的營養素[26]，其對固體飲料感官品質的影響如圖3所示。隨著VC添加量的增加，感官評分呈現先升高后降低趨勢，其最適添加量為0.20%。

圖3 VC添加量對產品感官評分的影響

2.2.2 糖醇添加量的確定

與蔗糖相比，糖醇具有低熱量、耐受量高、不致齲齒等優點，因此常作為代糖用于食品中[27]。分析圖4發現，糖醇對產品的甜度有很大影響，其最適添加量為65%。

圖4 糖醇添加量對產品感官評分的影響

2.2.3 速溶咖啡粉添加量的確定

咖啡是世界“三大飲料”之一，風味獨特，深受現代人喜愛[28]。分析圖5發現，速溶咖啡粉最適添加量為7.5%。

圖5 速溶咖啡粉添加量對產品感官評分的影響

2.3 配方優化

2.3.1 正交試驗結果及方差分析

采用正交試驗及方差分析對固體飲料配方進行優化。分析表5可知，各因素對固體飲料感官評分的影響主次順序為C＞A＞B，即速溶咖啡粉添加量＞VC添加量＞糖醇添加量。由表6方差分析可知，VC添加量、速溶咖啡粉添加量對固體飲料感官評分有極顯著的影響。通過極差分析法分析得到最優組合A1B2C2，即VC添加量0.20%、糖醇添加量65%、速溶咖啡粉添加量7.5%。

表5 正交試驗結果及分析

表6 正交試驗方差分析

2.3.2 單因素效應分析

為比較各因素對固體飲料風味的影響，對各因素進行鄧肯檢驗分析，結果見表7～表9。分析發現，VC添加量及速溶咖啡粉添加量的各水平間均具有顯著性差異，糖醇添加量的水平2和3間具有顯著性差異，且各輔料最適添加量分別為A1、B2和C2，即VC添加量0.20%、糖醇添加量65%、速溶咖啡粉添加量7.5%，與極差分析結果相一致。

表7 VC添加量單因素效應分析

表9 速溶咖啡粉添加量單因素效應分析

表8 糖醇添加量單因素效應分析

2.4 產品感官結果驗證

通過試驗確定牡蠣肽與海參肽添加比例10∶1（g/g），VC 0.20%、糖醇65%，速溶咖啡粉7.5%。在此條件下，經過3次重復性試驗驗證，感官評定平均綜合評分為93.2分。

2.5 產品活性檢測

2.5.1 產品性功能活性檢測

對產品（P）進行性功能活性檢測，并與市場流通較好的2個競品（J1、J2）進行比較。分析圖6發現，與CT相比，P組的各項性行為指標均顯著改善，表明P組具有顯著的性功能增強活性。與J1組相比，P組各項性行為指標均強于J1組，其中捕捉潛伏期、射精潛伏期及射精次數具有統計學顯著性差異（P＜0.05）。與J2組相比，其射精潛伏期顯著縮短，射精次數顯著增加（P＜0.05），表明產品的性功能增強活性強于2個競品。

圖6 產品性功能活性檢測

2.5.2 產品抗疲勞活性檢測

對產品（P）進行抗疲勞活性檢測，并與市場流通較好的2個競品（J1、J2）進行比較。分析圖7發現，與CT、J1、J2組相比，P組的游泳時間均顯著延長，表明P組具有顯著的抗疲勞活性且活性強于2個競品。

圖7 產品抗疲勞活性檢測

2.6 產品營養及質量檢測

對研發的海洋特色復合多肽固體飲料進行營養及質量檢測，結果顯示（表10），研發的產品蛋白質含量豐富（24.8 g/100 g），脂肪含量低（2.5 g/100 g），含有鋅元素（8.47 mg/100 g），且微生物指標及理化指標均符合國家相關標準要求，是一款高蛋白低脂肪、營養豐富的安全產品。

表10 產品檢測結果

3 結論

試驗以海洋源多肽為主要原料，研制一款固體飲料，通過體內外及單因素試驗、正交試驗確定最佳配方：牡蠣肽與海參肽添加比例為10∶1（g/g），VC 0.20%，糖醇65%，速溶咖啡粉7.5%。按此配方研制的海洋特色復合多肽固體飲料是一款色澤均一，酸甜適宜，無腥味、無蔗糖、無香精色素，具有獨特咖啡風味且各項指標均符合國家標準的天然功能食品。此外，活性試驗表明，該固體飲料具有增強小鼠性功能及抗疲勞的作用，且活性強于市場流通較好的2個競品產品，具有開發應用潛力，有望成為男性性功能障礙患者及疲勞人群的一種安全無后顧之憂的新選擇。