基于不同糟制溫度對酒糟魚理化性質及蛋白質降解的研究

汪曉瑜，趙利，白春清，陳麗麗，袁美蘭，江勇

1.國家淡水魚加工技術研發(fā)分中心（南昌 330013）；2.江西科技師范大學生命科學學院（南昌 330013）

酒糟魚是我國江西特產，它是以新鮮草魚等為原料，經鹽浸、干燥、糟制等工序加工制成[1-2]。糟制過程是酒糟魚風味物質形成的關鍵，糟制后的魚肉不僅具有腌制后的臘香味還有糟制形成的酒香味，酒糟呈白色、淺黃色至黃色。毛安康等[3]以新鮮草魚為原料，從腌制、脫腥、糟制等方面探究最佳酒糟魚生產工藝條件，以期開發(fā)出品質好、口感佳、受消費者喜愛的酒糟草魚制品，為草魚工業(yè)化生產加工提供理論依據。糟制過程中魚肉在酒糟的作用下繼續(xù)發(fā)酵，產生濃濃的酒香味和具有特征氣味的風味物質，糟制發(fā)酵后的魚肉制品的口感、風味得到改善，其營養(yǎng)價值和安全性也得到提高[4-5]。

蛋白質在糟制過程中會發(fā)生不同程度的水解。肌肉組織的蛋白質主要分為三類，包括肌原纖維蛋白質、肌漿蛋白質以及不溶性基質蛋白質。肌漿蛋白占魚體肌肉組織總蛋白的30%，與魚肉的顏色、風味、滋味以及持水性等相關，可間接影響魚肉品質[6]。研究以酒糟魚為對象，考察其在不同糟制溫度下pH、粗蛋白含量、TCA-可溶性肽含量、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量、氨基酸態(tài)氮以及蛋白組成含量、亞硝酸鹽含量的變化，探究酒糟魚在糟制過程中品質及蛋白質降解這一過程，為后續(xù)酒糟魚工業(yè)化生產以及保鮮技術提高產品品質提供可借鑒依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮草魚、糯米、甜酒曲、辣椒粉、姜、蒜、食用鹽，均購自經開區(qū)樂買佳超市。

1.2 試驗試劑

亞硝酸鈉（天津市福晨化學試劑廠）；氫氧化鈉、硫酸銅、95%乙醇、SDS、鹽酸（西隴科學股份有限公司）；三氯乙酸、硼酸（天津市大茂化學試劑廠）；硫酸鉀（西隴化工股份有限公司）；氧化鎂（上海展云化工有限公司）。均為分析純。

1.3 儀器與設備

HZF-A1000電子分析天平（福州華志科學儀器有限公司）；TGL-18M高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；U-T6A紫外可見分光光度計[屹譜儀器制造（上海）有限公司]；SPX-100B-Z恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；DK-S26恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；Sorvall EVOLUTION RC落地式高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技實驗室產品）；IKA分散機（深圳市三莉科技有限公司）；PHS-3C精密PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 酒糟魚的制備

魚塊制備：選擇質量在2～3 kg的新鮮草魚，經去腮、去魚鱗、去內臟、去脊椎骨和頭，清洗后瀝干，切成3 cm×3 cm×2 cm塊狀，添加7%食鹽、2.5%姜和2.5%蒜、2%辣椒粉均勻涂抹于魚肉表面，并密封放置在冰箱4 ℃下腌制24 h。腌制結束后進行干燥過程。

酒糟制備：所需原料糯米與酒曲之比125∶1。首先將糯米用水浸泡一夜，瀝干水分進行蒸制20 min，取出后自然降溫散熱，米飯中加入酒曲，酒曲加入前用糯米量的1/2溫開水化開并攪拌均勻并在中間搭窩，密封29 ℃下發(fā)酵5 d。

糟制：按照魚與酒糟之比1∶2分別在4，12和16℃溫度下進行糟制，對魚肉進行第3，第6，第9，第12，第15和第18天的取樣。

1.4.2 酒糟魚預干制條件的選擇

比較腌制后的魚肉在16 ℃自然條件下風干以及在熱風干燥箱干燥水分變化情況。

1.4.3 酒糟魚不同糟制階段pH測定

準確稱取10 g糟制攪碎后的魚肉樣品，加入90 mL水，高速分散機高速勻漿2 min后靜置10 min，測定其上清液pH，重復3次。

1.4.4 酒糟魚不同糟制階段粗蛋白含量的測定

粗蛋白含量的測定采用凱氏定氮法。

1.4.5 酒糟魚不同糟制階段揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量的測定

揮發(fā)性鹽基氮含量采用半微量定氮法進行。

1.4.6 酒糟魚不同糟制階段氨基酸態(tài)氮含量的測定

采用甲醛滴定法。

1.4.7 酒糟魚不同糟制階段TCA-可溶性肽含量的測定

TCA-可溶性肽的測定參照王蔚新[7]方法。準確稱量2 g攪碎后的糟制魚肉樣，加入28 mL 5% TCA溶液，置于均質機均質3 min，接著在4 ℃下冷藏1 h后置于冷凍離心機在4 ℃、轉速5 000 r/min下離心10 min。采用雙縮脲法測定TCA-可溶性肽的含量，以酪蛋白作為標準品，繪制標準曲線，結果表示為mg酪氨酸/g樣品。

1.4.8 酒糟魚不同糟制階段亞硝酸鹽含量測定

參考GB 5009.33—2016中分光光度計法進行。

1.4.9 酒糟魚糟制過程中蛋白組成含量測定

酒糟魚蛋白質組成根據溶解度不同可以分為肌漿蛋白、肌原纖維蛋白和不溶性蛋白。各部分蛋白提取方法參考王蔚新[7]的方法，并作修改。準確稱取2 g（精確至0.001 g）攪碎后的魚肉，加入20 mL pH 6.5的0.02 mol/L PB磷酸緩沖溶液，勻漿2 min，冷凍離心機在4 ℃、轉速10 000 r/min下離心10 min，上清液即為肌漿蛋白部分。重復以上操作3次，合并上清液備用。取肌漿蛋白后的沉淀部分，加入20 mL pH 6.5的0.1 mol/L PB磷酸緩沖液，相同條件勻漿離心，上清液為肌原纖維蛋白部分。重復以上操作3次，合并上清液備用。取兩種蛋白后的沉淀部分，加入10 mL 5%的SDS，在恒溫水浴鍋80 ℃下加熱1 h后冷卻，即為不溶性蛋白。雙縮脲法測定各部分蛋白含量。

1.5 感官評定

對不同糟制溫度下的酒糟魚樣品進行無順序編號，邀請10名嗅覺味覺等感官良好的食品方向研究生或老師進行感官評定分析。

表1 酒糟魚感官評定標準表

2 結果與討論

2.1 酒糟魚預干制條件的選擇

由圖1和圖2可以看出，在自然風干和熱風干燥這兩種干燥方式條件下，0～6 d時間內水分含量都呈現下降趨勢，干燥后的魚肉水分減少，水分活度降低，有利于提高酒糟魚產品品質及保藏性。圖1中自然風干干燥條件下從第0天水分含量75.4%下降到第6天的44.8%，但水分下降較緩慢；圖2中60 ℃熱風干燥條件下水分下降較快，從第0小時的75.4%下降到第16小時的50.6%。由于糟制過程對魚肉水分要求較高，魚肉水分含量較高不利于糟制液的滲入；魚肉水分含量較低會導致魚肉表面干癟收縮，不利于糟制液滲入魚肉內部，影響酒糟魚制品的口感及風味形成。根據王蔚新[7]中魚段水分含量對糟制過程的影響，得出酒糟魚干燥終點在55%左右更有利于糟制過程，因此選定酒糟魚熱風干燥終點時魚肉水分含量約為55.3%，此時熱風干燥溫度為60 ℃，干燥時間為12 h。

圖1 自然風干條件下魚肉水分含量隨時間的變化

圖2 熱風干燥60 ℃條件下水分含量隨時間的變化

2.2 酒糟魚不同糟制階段pH測定

pH的大小可以作為評價魚肉腐敗變質情況的重要指標之一。糟制酒糟魚的糟制液呈酸性，由圖3可以看出，隨著糟制時間的延長，不同溫度下的酒糟魚pH都呈現下降的趨勢，第3～第6天下降速度較快，這是由于酒糟魚在糟制過程中糟制液的滲入。糟制第18天時4 ℃下的魚肉pH為5.69左右，12 ℃下的魚肉pH為5.59左右，16 ℃下的魚肉pH達到了5.43左右，差異顯著（P＜0.05）。溫度越高，pH的下降速率越快。這主要是由于溫度升高，糟制液內產酸微生物的生長速度越快，產酸增多導致的[8]。

圖3 酒糟魚肉在18 d內pH變化

2.3 酒糟魚粗蛋白及TCA-可溶性肽含量的測定

粗蛋白含量是魚肉中各種含氮物質的總稱，它包括真蛋白質和含氮物（氨化物），魚肉蛋白質含量一般在15%～24%之間。由圖4可以看出，在不同溫度下，隨著糟制時間的延長，粗蛋白含量都有略微降低，16 ℃下的魚肉粗蛋白含量相較于4 ℃和12 ℃有小幅度降低，但無明顯變化。溫度升高，對魚肉總氮含量并無明顯影響，且常溫糟制下能夠保持較高的粗蛋白含量。粗蛋白含量降低，一方面是由于糟制液的滲透作用，使得酒糟中的液態(tài)基質滲透到魚肉組織中；另一方面魚肉在微生物以及內源組織酶的代謝作用下，生成肽類、氨基酸態(tài)氮等含氮小分子物質。

圖4 酒糟魚在18 d內粗蛋白含量變化

三氯乙酸（TCA）是一種蛋白質沉淀劑和變性劑，由于糟制液呈酸性，它可以在酸性條件下與長鏈肽段以及蛋白質形成不溶性鹽類，進而沉淀出來。試驗對于魚肉而言，TCA-可溶性肽的溶解度可以定性反映糟制過程中魚肉蛋白質的水解情況，溶解指數越高，說明魚肉中不溶性鹽越少，較短肽段含量相對越高。由圖5可以看出，隨著糟制時間的延長，TCA-可溶性肽含量均逐漸升高，這是由于糟制液呈酸性，蛋白質在酸性條件下會發(fā)生水解，導致小分子肽的出現，同時會導致可溶性肽含量的升高。隨著溫度升高，蛋白質溶解度增加，TCA-可溶性肽含量越高。4 ℃下第18天魚肉的TCA-可溶性肽含量達到了10.33 mg tyrosine/g樣品，而16 ℃下第18天的魚肉TCA-可溶性肽含量高達11.71 mg tyrosine/g樣品。

圖5 酒糟魚糟制過程中TCA-可溶性肽含量變化

2.4 酒糟魚糟制過程中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量的測定

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量可以用來表征食品的化學動力學模型，它是評價肉及肉制品鮮度的重要指標。它描述的是動物性食品在酶、細菌以及微生物作用下發(fā)生腐敗變質，使蛋白質分解成胺類以及氨等堿性腐敗性物質的情況，其含量越高說明氨基酸被破壞得越多，食品腐敗破壞越嚴重。目前，應用TVB-N構建食品化學動力學模型以期預測食品的貨架期[9-11]已被研究。由圖6可以看出，隨著糟制時間的延長，揮發(fā)性鹽基氮含量逐漸增加，這是由于在糟制過程中，魚肉中的蛋白質在酶以及微生物作用下發(fā)生水解產生氨及胺類等堿性有毒腐敗物質，且腐敗越嚴重。16 ℃下TVB-N含量相較于12 ℃以及4 ℃都有小幅度上升，這是由于溫度越高，蛋白質降解速率越快，產生氨及胺類物質更多。16 ℃糟制終點揮發(fā)性鹽基氮含量為11.98 mg/100 g，未超過食品安全國家標準中規(guī)定的最大值20 mg/100 g。

圖6 酒糟魚糟制過程中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量變化

2.5 酒糟魚糟制過程中氨基酸態(tài)氮含量的測定

氨基酸態(tài)氮含量的多少可以一定程度反應糟制過程中蛋白質的水解程度，氨基酸態(tài)氮含量升高，說明魚肉在被內源酶以及微生物水解，且含量越高，代表反應過程蛋白質水解越劇烈。由圖7可以看出，隨著糟制時間的延長，第3～第12天氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高，第12天之后含量逐漸降低，這是由于糟制過程中蛋白質發(fā)生了水解，水解產生的氨基酸作為糟制過程中魚肉風味物質的前體物質，在微生物及組織酶的作用下最終會產生酒糟特有的風味。氨基酸態(tài)氮作為蛋白質的中間降解產物[12]，在糟制過程中會進一步代謝為氨基酸等小分子物質。類似于糟制過程中揮發(fā)性鹽基氮含量變化，16 ℃下的氨基酸態(tài)氮含量高于12℃和4 ℃下氨基酸態(tài)氮的含量，這可能是由于溫度升高，微生物以及內源酶酶活力增強，對蛋白質降解過程具有促進作用，從而加快氨基酸態(tài)氮的生成。

圖7 酒糟魚糟制過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化

2.6 酒糟魚糟制過程中亞硝酸鹽含量的測定

亞硝酸鹽在火腿、香腸等肉類食品中被廣泛使用。由圖8可以看出，隨著糟制時間的延長，三種溫度下的亞硝酸鹽含量都呈現下降趨勢。4 ℃冷藏下的酒糟魚亞硝酸鹽含量比12 ℃下的亞硝酸鹽含量高，12℃下的亞硝酸鹽含量高于16 ℃下的亞硝酸鹽含量，且含量在不同糟制溫度下的差異極顯著（P＜0.05）。室溫環(huán)境下溫度越高，魚肉中的微生物更容易分解亞硝酸鹽，也可能是室溫更有利于亞硝酸鹽的降解[13]。按照我國食品安全管理規(guī)定，腌制食品中亞硝酸鹽含量不應超過20 mg/kg[14]。

圖8 酒糟魚糟制過程中亞硝酸鹽含量變化

2.7 酒糟魚蛋白組成含量的測定

肌漿蛋白為水溶性蛋白質，主要與魚肉的呈味特性和色澤有關，還可參與細胞的代謝反應[15]。由圖9可以看出，隨著糟制時間的延長，肌漿蛋白含量呈現下降趨勢，一方面是由于酒糟魚發(fā)酵過程中pH下降導致肌漿蛋白等可溶性蛋白發(fā)生變性，溶解度下降，含量減少；另一方面原因是pH下降導致魚肉組織蛋白的水解，產生氨基酸和肽類等物質。圖5所示TCA-可溶性肽含量的增加也同樣證實了蛋白質在糟制中發(fā)生的水解現象。隨著溫度升高，肌漿蛋白含量越高，這可能是由于溫度升高，內源酶及組織蛋白酶活增強，酒糟魚蛋白質溶解度也隨之升高，魚肉鮮度降低。

圖9 酒糟魚糟制18 d肌漿蛋白含量的變化過程

肌原纖維蛋白為鹽溶性蛋白質，在魚肉糟制過程中易受溫度和pH等因素影響。從圖10可以看出，相較于肌漿蛋白，肌原纖維蛋白含量略低。不同溫度下，隨著糟制時間的延長，肌原纖維蛋白含量呈現下降趨勢，和肌漿蛋白含量變化趨勢相似，這同樣是由于酒糟魚在糟制發(fā)酵過程pH下降導致肌原纖維蛋白這種可溶解蛋白的溶解度下降和蛋白水解現象。糟制溫度升高，蛋白質溶解度隨之升高，肌原纖維蛋白含量增多。

圖10 酒糟魚糟制18 d肌原纖維蛋白含量的變化過程

不溶性蛋白指不溶于水以及鹽溶液的剩余殘渣部分，它與魚肉嫩度關系密切。由圖11可以看出，不溶性蛋白含量比肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量高。在第3～第18天，不溶性蛋白含量呈現上升趨勢，這是由于pH下降以及蛋白質發(fā)生水解，導致肌漿蛋白以及肌原纖維蛋白這兩種可溶解性蛋白含量降低，進而轉化成不溶性蛋白導致含量增多。同一時間內，溫度越高含量越低，這是由于可溶性蛋白溶解度隨著溫度升高而升高，轉化成不溶性蛋白含量隨之減少。

圖11 酒糟魚糟制過程中不溶性蛋白含量變化趨勢

2.8 不同糟制溫度下酒糟魚感官評定

食品感官評定在食品中應用非常廣泛，它可以在一定程度上反應食品的某些感官品質的優(yōu)良與否，感官評定來評價食品的品質，簡單易行、直觀性強[16]。從圖12可看出，16 ℃下糟制的魚肉質構品質較好，且酒香味比4 ℃和12 ℃下的更濃郁，外觀品質隨著溫度的升高而提高。綜合評定，16 ℃下的感官品質最受歡迎。

圖12 不同糟制溫度下酒糟魚感官評定

3 結論與討論

通過研究不同溫度（4，12和16 ℃）下糟制18 d對酒糟魚品質特性的影響，結果表明：隨著糟制時間的延長，pH呈現下降趨勢，粗蛋白含量0～18 d內有小幅度減少，并無顯著變化，TCA-可溶性肽含量、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量都逐漸升高，氨基酸態(tài)氮含量先增加后減少，亞硝酸鹽含量逐漸降低，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白含量降低，不溶性蛋白含量升高。隨著糟制溫度升高，變化趨勢越明顯。結合感官評定結果，16 ℃下的糟制魚肉在質構和口感方面品質最好。綜上說明在不同糟制溫度下酒糟魚蛋白質發(fā)生了不同程度的降解，且溫度升高蛋白質降解越劇烈。