仲花茶飲降血糖血脂的生物活性

張錦華，劉鑫毅，李曉晶，白寶清，范三紅*

1.山西大學生命科學學院（太原 030006）；2.特色植物資源研究與利用山西重點實驗室，山西大學（太原 030006）；3.太原生態工程學校（太原 030025）；4.岳康藥業集團有限公司（臨汾 042500）

目前市場存在很多種類的茶飲料，如：純茶飲料，包括綠茶、花茶、烏龍茶等；調味茶飲料，如果汁飲料、奶茶飲料等；含汽茶飲料，如碳酸茶飲料；冰茶以及復合茶飲料[1-3]。隨著時代的進步，由傳統的泡茶手法而得的茶飲料已經不能滿足市場的需求，所以目前的企業都紛紛轉向了復合型茶飲料市場，通過采用不同原料、不同配比等方法，研發出具有特殊香氣、口感以及一定保健功能的新型茶飲料。

岳康藥業集團有限公司研發的仲花茶飲，配方以槐花、杜仲葉、炒決明子、黃精、薏苡仁、當歸、姜黃、紅花為主。槐花具有清肝瀉火等功效，現代研究表明，槐花不僅含有人體的必需營養素，還富含多種植物化學成分，有抗氧化、抗炎、降血壓、調節免疫等保健功效[4-5]。決明子是豆科決明屬植物的干燥成熟種子，能夠去火祛濕，清熱解毒[6]。是一種藥食同源的中藥，現代醫學研究表明，決明子具有保護肝臟、降壓、調血脂和抑菌、抗氧化等作用[7]。薏苡仁是一種常見的中藥，其中富含多種人體所需物質[8]，現代藥理研究表明，薏苡仁具有降血壓、改善糖脂代謝、調節腸道菌群、美白等作用[9]。當歸是一種常見中藥材，具有改善腸道、補足氣血、調節經期的功效[10-11]。姜黃屬于姜科植物，具有行氣破淤、通經止痛的功效[12]，從姜黃中可提取出姜黃素，姜黃素是一種天然色素，研究表明，姜黃素不僅具有抗癌、抗風濕等功能，還具有改善免疫系統、心血管系統等多種功能[13-14]。桃仁中含有多種活性物質，包括脂肪油類、苷類、蛋白質和氨基酸等[15]，具有改善腸道、除火祛濕、鎮咳祛痰等功效[16]。

糖尿病是我國常見的一種慢性疾病，患病率高達10.9%[17]。糖尿病的特征是血糖升高，根據不同的發病原因還分為1型糖尿病與2型糖尿病，患者往往還會患有高血脂，動脈粥樣硬化等并發癥[18]。糖尿病目前已經是我國居民所面臨的主要病癥之一，目前的治療手段仍不能取得較好的效果，需要積極地探索新的治療方案[19]。最新的研究發現，利用從植物中提取的多酚[20]、多糖[21]等物質，可以對高血糖動物造成顯著的降血糖效果。

為了明確該茶飲降糖降脂功效，研究對仲花茶飲的降血糖能力與抗氧化能力進行了測試，證實了仲花茶飲的降血糖功效，為其開發和應用提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

仲花茶飲由岳康藥業集團有限公司提供。

SPF級昆明小鼠60只（斯貝福生物技術有限公司）；高糖高脂飼料（南京盛民科研動物公司）；基礎飼料與飼養環境由中國防護輻射院提供。

鏈脲佐菌素（STZ）（上海麥克林生化科技有限公司）；鹽酸二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）。

1.2 儀器與設備

三諾血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；酶標儀（美國惠普公司）；石蠟包埋機（Histocentre）；Finesse325石蠟切片機（英國Shandon）；Excelsior全自動組織脫水機（英國Shandon）；BX53熒光顯微成像系統（日本Olympus公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 高血糖血脂造模

小鼠經過3 d的適應期后，稱重并斷食12 h測初始血糖。在60只小鼠中，隨機選取10只正常小鼠作為空白對照組，其余全部作為造模試驗組。造模組小鼠投喂高糖高脂飼料，禁食不禁水12 h，并注射55 mg/kg STZ（現配現用）誘導小鼠血糖升高。一月后，尾靜脈取血測小鼠血糖，小鼠的血糖大于11.1 mmol/L為造模成功。空白對照組（標記為NG）喂養基礎飼料，灌胃等量的生理鹽水[22]。

1.3.2 試驗分組

將50只造模組小鼠隨機分為五組，分別是模型組（標記為DM），陽性對照組（標記為MET），低劑量組（標記為ZH-1），中劑量組（標記為ZH-2），高劑量組（標記為ZH-4），低、中、高劑量組分別以100，200和400 mg/kg含量的仲花茶飲進行灌胃，空白組和模型組按200 mg/kg的質量分數灌胃等量的生理鹽水，陽性對照組灌胃中劑量200 mg/kg濃度的鹽酸二甲雙胍。試驗結束后水合氯醛麻醉，并脫臼致死[22]。

1.3.3 糖耐量測試

在27 d，小鼠經過12 h禁食后用50%的葡萄糖溶液以2 g/kg對其進行腹腔注射，再經過0，30，60，90和120 min后進行短尾取血，測定血糖值[22]。

1.3.4 體重、血糖及肝臟指數測定

分別在造模后的第7，第14，第21和第28天進行禁食、稱重并測血糖，肝臟指數的計算公式見式（1）。

1.3.5 小鼠血脂指標的測定

在28 d后，摘取小鼠眼球，并對眼球取血，再以4 000 r/min轉速離心，收集上清液，用試劑盒分別測定小鼠的血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C），低密度脂蛋白（LDL-C）。

1.3.6 小鼠抗氧化指標的測定

在28 d后，摘取小鼠眼球，并立即進行解剖，摘取小鼠肝臟。小鼠肝臟經生理鹽水清洗后進行稱重，再與生理鹽水1∶9混勻均質，將均質后的溶液以3 000 r/min轉速離心，收集上清液，分別用試劑盒測提取液中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活力及丙二醛（MDA）的含量[22]。

1.3.7 胰腺組織切片處理

參考文獻[23]。切片方法：第28天試驗結束時進行肢解，采集樣本，取大鼠胰腺，即刻收入10%中性福爾馬林液中，固定48 h，按常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及HE染色，取組織經自來水沖洗固定液，酒精梯度脫水后（70%，80%，95%Ⅰ，95%Ⅱ，100%Ⅰ和100%Ⅱ），對組織進行透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ），浸蠟（石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ）后包埋，包埋后的組織3～5 μm切片，經60 ℃烤片后進行H-E染色（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟，過100%Ⅰ，100%Ⅱ，95%Ⅰ，95%Ⅱ，80%和70%的梯度酒精，經蘇木素染色、分化、反藍，伊紅染色，過70%，80%，95%Ⅰ，95%Ⅱ，100%Ⅰ和100%Ⅱ梯度酒精），最后用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明后樹膠封片，待鏡檢。

1.3.8 腸道微生物Alpha多樣性分析

無菌環境中收集各組的新鮮糞便，收集到離心管中，液氮冷凍。提取糞便DNA并測序，進行OTU聚類分析、腸道微生物Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。

1.3.9 數據分析與處理

數據處理使用SPSS 21.0，作圖使用Origin 8.5，數據分析使用Statistics。腸道微生物送由諾禾致源公司16s擴增測序。

2 結果與分析

2.1 仲花茶飲對小鼠體重的影響

經觀察可知，各組小鼠在適應階段體重基本一致，而造模后的高血糖小鼠具有毛發無光澤、多食多尿等特征。由圖1可知，在整個試驗過程中模型組小鼠體重逐漸下降，第4周體重比初始降低了6%，空白對照組小鼠體重不斷增大，增長率10%。在灌胃3周時，仲花茶飲劑量組小鼠體重都有明顯的升高，高劑量組體重升高了4.4%，中劑量組體重升高了3.3%。從圖1中可以明顯看到，與空白對照組（NG）和陽性對照組（MET）相比，體重升高的趨勢顯著降低，表示了仲花茶飲的降體重功能。

圖1 仲花茶飲對小鼠體重的影響

2.2 仲花茶飲對小鼠血糖的影響

圖2為試驗期間仲花茶飲對各組小鼠的血糖值的影響。試驗初期各小組小鼠血糖值差異不顯著，造模成功后，各組小鼠與空白組的血糖值具有明顯差異。灌胃4周時，空白組血糖保持穩定，模型組小鼠血糖顯著升高，其余組小鼠血糖均有不同程度降低，高劑量組降血糖效果明顯，4周后高劑量組和陽性對照組基本持平，說明仲花茶飲具有良好的降血糖效果。

圖2 仲花茶飲對小鼠血糖的影響

2.3 仲花茶飲對小鼠血脂的影響

糖尿病是一種代謝性疾病[24]。這種代謝問題主要是由于脂肪酶的代謝發生問題，導致患者體內TC、TG、LDL-C水平的升高，HDL-C水平的降低[25]。仲花茶飲對小鼠血脂的影響如圖3所示。在各模型組小鼠血糖中發現，4種檢測指標均與空白對照組存在顯著差異，證明在模型組小鼠中存在脂代謝紊亂問題。

圖3 仲花茶飲對小鼠血脂的影響

在灌胃不同劑量仲花茶飲的小鼠中，血清TC值與劑量呈反比關系，高劑量組血清TC值與空白對照組無明顯差異，與模型組小鼠TC值存在顯著差異，說明仲花茶飲具有一定的減少高血糖小鼠體內TC含量的功效，且其降TC含量的能力與給藥劑量呈正比關系，其中高劑量組比模型組降低了45.5%，低劑量組比模型組降低了27.49%較陽性對照有所降低；從血糖中TG值分析，模型組小鼠血糖中TG值最高，與空白對照組小鼠TG值存在顯著差異。而在各試驗組中，仲花茶飲高劑量組優于模型組，低劑量組TG值較模型組降低了27.35%，中劑量和高劑量組TG含量和陽性對照TG含量接近，且比模型組降低了52.75%，說明仲花茶飲具有減少小鼠血清中TG水平、抑制小鼠體內的脂代謝紊亂問題的功效；仲花給藥組的HDLC含量明顯高于模型組，且空白對照，陽性對照，高劑量組HDLC含量接近，高劑量組比模型組含量高48.25%，效果顯著；在給藥組中各小鼠的LDL-C值明顯低于模型組，且與給藥量為反比關系，低劑量較模型組低20.36%，中劑量較模型組低34.51%，高劑量較模型組低51.33%。

2.4 仲花茶飲對小鼠肝氧化損傷的影響

比較常見的抗氧化酶有SOD、CAT、GSH-Px等[26-27]。MDA是一種脂質氧化過程中的副產物，能夠反應小鼠的脂肪代謝功能[28]。如圖4所示，模型組小鼠的CAT、SOD、GSH-Px水平顯著低于空白對照組小鼠，而MDA水平上升顯著，說明在模型組小鼠的體能發生了嚴重的過氧化反應。在對小鼠灌胃仲花茶飲后，小鼠的過氧化反應程度均發生緩解，且SOD、GSH-Px、CAT與給藥劑量呈反比關系，MDA與給藥劑量呈正比關系，表明仲花茶飲能夠抑制高血糖小鼠體內的過氧化反應，提高小鼠的肝臟抗氧化能力，且功效與劑量呈正相關。

圖4 仲花茶飲對小鼠抗氧化指標的影響

2.5 仲花茶飲對小鼠胰腺組織的影響

試驗結束后，由圖5可以看出：正常小鼠的胰島細胞形態完整、邊界清晰，數量較多；模型組小鼠的胰島內細胞邊界不清并且數目有所減少，胰島細胞受損程度較嚴重；仲花茶飲給藥組的小鼠細胞邊界較模型組而言清晰且胰島內細胞數目對比模型組有所增加，細胞體積有所增大，由此可以推測仲花茶飲可能具有修復損傷的胰島細胞的作用，進而對糖尿病起到治療作用。

圖5 試驗小鼠胰島組織病理學檢查結果

2.6 仲花茶飲對小鼠腸道菌群的影響

韋恩圖結果如圖6所示。5組重疊部分代表組間共有的OTUs，共409個，而每個組特有的OTU數量則不同，正常組NC有36個，模型組DM有74個，低劑量組ZH.L有346個、中劑量組ZH.M有1 308個，高劑量組ZH.H有358個，說明仲花具有調節糖尿病小鼠腸道微生物作用，且中劑量組效果優于低劑量組和高劑量組；模型組DM、低劑量組ZH.L、中劑量組ZH.M和高劑量組ZH.H與正常組NC單獨重合OTU個數分別為：12、84、8和2，說明低劑量組ZH.L與正常組NC的OTU相似度高于模型組DM與正常組NC。

圖6 小鼠腸道菌群OUT聚類分析

由表1數據可知，模型組的腸道菌群shanon指數和simpson指數低于正常組，說明經STZ誘導的糖尿病小鼠的腸道菌群多樣性降低，與模型組相比，不同給藥組均能夠提高shanon指數、chao1指數和ACE指數，表明仲花茶飲能夠增加糖尿病小鼠腸道菌群的多樣性和豐富度。總而言之，患有糖尿病的小鼠其腸道微生物多樣性遭到破壞，導致腸道菌群失調，而通過仲花茶飲干預可以一定程度上調節和改善失調的腸道菌群。

表1 Alpha多樣性指數分析

圖7為所有樣本的PCoA分析，由圖可以看出PC1的貢獻度為40.27%，PC2的貢獻度為15.6%，空白組樣本和模型組樣本分別相對集中在一個單獨區域，說明正常小鼠和糖尿病小鼠的群落結構具有差異性。陽性對照組沿著PC1和PC2遠離模型組，更接近正常組，且組內中心連接點與正常組中心點的距離小于模型組與正常組的距離，代表腸道菌群結構發生了變化。仲花茶飲組組內個體間雖然不明顯聚集，但大都表現出偏離模型組向正常組靠近的趨勢，說明仲花茶飲可以調節腸道菌群物種結構組成、減小由STZ誘導的糖尿病小鼠與正常小鼠腸道菌群物種組之間的差異，能改變腸道菌群的分布，改善腸道菌群失調。

圖7 小鼠腸道菌群Beta多樣性分析

3 結論

研究以仲花茶飲為對象，以人工培育的高血糖模型鼠為試驗體，進行灌胃試驗，考察其對試驗體血糖、血脂、抗氧化指標、胰腺組織以及腸道菌群的影響。在結果中發現仲花茶飲對于高脂小鼠的各項指標均具有顯著的改善效應，表明仲花茶飲在治療糖尿病以及各種并發癥的過程中可以起到顯著的改善作用，有廣闊的開發前景。