C30色譜柱HPLC法分析測定蔬菜中阿維菌素殘留量

林洋，郁蕉竹，許文雅，張宏宏，王韻，劉瀛

沈陽食品藥品檢驗所（沈陽 110136）

阿維菌素類藥物（avermectins，AVMs）是由鏈霉素產生的一組十六元環內酯雙糖類化合物，是經過微生物發酵、提取的新型抗生素類殺蟲殺螨劑，對螨類和昆蟲具有胃毒和觸殺作用，是現代農業廣泛應用的一種抗寄生蟲農藥[1-3]。關于阿維菌素的檢測方法國內外已有大量報道，張紅艷等[4]建立甲醇提取測定黃瓜中阿維菌素殘留量。王曉菁等[5]建立酸性乙腈溶液提取來分析枸杞中阿維菌素殘留量。此外阿維菌素檢測方法還有液質聯用法[6-11]、高效液相色譜熒光法[12-14]，但液相質譜法運營成本相對較高，而熒光法前處理又較為復雜繁瑣，穩定性差。檢測阿維菌素殘留量大多使用GB 23200.19—2016《食品安全國家標準 水果和蔬菜中阿維菌素殘留量的測定 液相色譜法》，采用C18色譜柱進行色譜分離，但此方法對于基質復雜的蔬菜樣品的測定雜質干擾問題較為嚴重，主峰與雜質峰分離效果不理想[15]。在液相色譜檢測阿維菌素殘留量中采用C30色譜柱進行色譜分離的方法鮮有報道，試驗選用乙腈作為提取溶劑替代國標中的丙酮提取，選用C30色譜柱進行色譜分離，通過優化色譜條件，減少蔬菜基質中雜質峰的背景干擾，從而提高方法的準確性和重復性，優化阿維菌素的高效液相色譜檢測方法，為同行業蔬菜中阿維菌素殘留量的測定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；氯化鈉（分析純，國藥集團化學制藥有限公司）；阿維菌素標準品（100 mg/L，安譜實驗科技股份有限公司）；C18固相萃取柱（60 mg，3 mL，安譜實驗科技股份有限公司）；Athena C30色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，安譜實驗科技股份有限公司）；試驗用水均為一級水；菠菜、大白菜、蘿卜、馬鈴薯、豇豆、小白菜（市購）。

1.2 主要儀器與設備

Waters e2695高效液相色譜儀（配2998二極管陣列檢測器，美國Waters公司）；超聲波清洗儀（KQ-250DB，昆山市超聲儀器有限公司）；德國IKA渦旋混合器；高速冷凍離心機（H1750R，湖南湘儀離心機儀器有限公司）；萊伯泰科多通道平行濃縮儀（M64）；常熟雙杰電子天平（JJ600）；Milli-Qreference純水機（Millipoer SAS公司）；移液器（20～200 μL，705878及100～1 000 μL，705880，普蘭德公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 樣品前處理

蔬菜樣品采用四分法取樣，經粉碎機絞碎后均勻混合，準確稱取10.00 g均勻試樣于具塞塑料離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩，超聲提取30 min，加入3～4 g氯化鈉，振蕩搖勻，按10 000 r/min離心5 min，取上清液于離心管中，用10 mL乙腈重復提取1次，合并提取液。在40 ℃水浴下氮吹近干。加入1 mL甲醇復溶，渦旋溶解，加入3 mL水渦旋混勻待凈化。將固相萃取柱依次用5 mL甲醇活化、5 mL水平衡，將上述溶液完全轉入C18固相萃取柱，用5 mL水淋洗小柱，棄去全部淋洗液，最后用5 mL甲醇洗脫并抽干，收集洗脫液，用氮氣吹至近干。準確加入0.5 mL甲醇溶解殘渣，用0.22 μm有機濾膜過濾，濾液供液相色譜測定，外標法定量。

1.3.2 色譜條件

色譜柱C30柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（85∶15，V/V）；流速1.0 mL/min；檢測波長245 nm；進樣量20 μL；柱溫35 ℃；檢測器采用二極管陣列檢測器。

1.3.3 標準溶液的配制

分別準確移取0.050，0.075，0.100，0.200和0.500 mL質量濃度為100 mg/L的阿維菌素標準溶液于10 mL容量瓶中，加甲醇定容到刻度，輕搖混勻，標準系列工作溶液中阿維菌素的質量濃度分別為0.50，0.75，1.00，2.00和5.00 mg/L。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇與比較

2.1.1 提取溶劑的選擇

已報道的阿維菌素提取溶劑有丙酮[16]、甲醇[17]、乙酸乙酯[18]和乙腈[19-20]溶液等，提取方式包括超聲、渦旋、振蕩或均質等，試驗分別采用丙酮、乙腈、甲醇作為提取劑對樣品進行超聲提取，發現甲醇和丙酮作為提取劑時基質干擾較多，且樣品中水分對下一步凈化效果也有影響，因此試驗方法采用乙腈提取，并加入氯化鈉進行鹽析來分離水相有機相，促進目標分析物與有機相融合，該方法有較高提取率同時也減少樣品中雜質的提出；且國家標準中使用的丙酮提取劑屬易致毒易致爆溶劑，而乙腈毒性和安全性相對丙酮較小。因此通過綜合操作安全性簡便性、提取效率和凈化效果方面，最終選用乙腈作為提取劑。

2.1.2 凈化方法的比較

常見凈化方法有液-液萃取法、固相萃取小柱凈化法等，由于蔬菜樣品提取液色澤較深，基質干擾較多，含有大量色素、有機質和鹽類，選取最優的分離純化方法會在最大程度降低樣品基質干擾，提高分析方法的準確性和精密度。試驗分別測試直提后上樣、C18固相萃取凈化柱、氨基柱、氧化鋁層析柱的凈化方法，其中乙腈提取后直接上樣基質干擾嚴重，氧化鋁層析柱和氨基柱對基質除雜和回收效果均不理想；試驗對比待凈化液中甲醇含量對回收效果影響，甲醇含量分別為20%，25%和30%時上樣凈化的回收率分別為95.2%，97.6%和96.2%，其中用25%甲醇含量的待凈化液過凈化柱回收率最高。因此該方法采用甲醇含量25%的待凈化液過C18固相萃取柱進行凈化。

2.2 色譜條件的選擇與比較

使用的C18色譜柱大多數都是使用單官能團硅烷化試劑鍵合形成的單層鍵合相，也有使用雙官能團或三官能團硅烷試劑鍵合形成的多層鍵合相，也稱為聚合型鍵合相。C30鍵合相具有比C18更長的烷基鏈，有更強的疏水性，在硅膠表面形成致密的多層C30烷基鏈。由于多層鍵合相可以形成更為致密的鍵合層，能更加有效地掩蔽硅膠表面的硅羥基，同時具有更強的溶質保留能力和對強極性物質更小的非特異性吸附，對非極性溶質的保留能力和分辨率更高，具有非常好的分離能力。基于多層聚合型鍵合相的優勢和C30烷基鏈優異的分離效果，試驗以甲醇和水為流動相，以加標菠菜樣品為基質，對比C18色譜柱和C30色譜柱及不同流動相比例條件下的中阿維菌素與雜質峰的分離效果，見圖1～圖5。圖譜表明，使用C30色譜柱分離菠菜基質中阿維菌素效果明顯優于C18色譜柱，其中采用C30色譜柱、甲醇-水（85∶15，V/V）作為流動相時，阿維菌素主峰與雜質峰分離度R＞1.5，分離效果最佳，雜質干擾最小。

圖1 C18色譜柱、甲醇-水（90∶10，V/V）為流動相分離菠菜基質中阿維菌素色譜圖

圖2 C18色譜柱、甲醇-水（85∶15，V/V）為流動相分離菠菜基質中阿維菌素色譜圖

圖3 C30色譜柱、甲醇-水（90∶10，V/V）為流動相分離菠菜基質中阿維菌素色譜圖

圖4 C30色譜柱、甲醇-水（85∶15，V/V）為流動相分離菠菜基質中阿維菌素色譜圖

圖5 C30色譜柱、甲醇-水（85∶15，V/V）為流動相阿維菌素標準品色譜圖

2.3 線性關系和定量限

在上述試驗條件下測定0.50，0.75，1.00，2.00和5.00 mg/L系列質量濃度的阿維菌素標準溶液，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制線性關系曲線，得到的線性方程為Y=40 800X-355，其中r2值為0.999 8，結果表明在0.50～5.00 mg/L范圍內有良好的線性關系。配制適當濃度的阿維菌素標準溶液，在上述條件下平行測定6次，按照rSN=10計算得出方法定量限為0.01 mg/kg，滿足食品安全國家標準GB 23200.19—2016要求。

2.4 準確度和精密度

在菠菜樣品空白基質中分別添加0.01，0.05和0.10 mg/kg的阿維菌素標準品，按照上述試驗條件進行加標回收試驗，每個加標水平重復測定6次，外標法定量測得阿維菌素的平均回收率和相對標準偏差（SRSD），結果見表1。阿維菌素的加標平均回收率為93.7%～97.5%，其SRSD值為1.1%～2.2%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》要求，且方法具有良好的重復性。

表1 回收率與相對標準偏差（n=6）

2.5 蔬菜樣品參考分析

隨機選取大白菜、蘿卜、馬鈴薯、豇豆、小白菜5種實際蔬菜樣品，在基質中分別添加0.05 mg/kg的阿維菌素標準品，按上述測試條件進行加標回收試驗，試驗結果見表2。測得5種蔬菜樣品中阿維菌素含量的回收率為92.8%～102.4%，SRSD值為1.1%～4.5%（n=6），回收率和精密度均滿足試驗要求。

表2 實際樣品中阿維菌素殘留量回收率和精密度試驗結果（n=6）

3 結論

建立蔬菜中阿維菌素殘留量分析檢測的高效液相色譜法，前處理方面采用乙腈進行超聲提取，鹽析分離，SPE小柱固相進行萃取，減少色素和脂質的吸附，與國家標準中采用丙酮提取前處理方法相比，毒性小、操作簡便快捷、基質干擾影響小；儀器測定方面采用二極管陣列檢測器，普及率高，結果定量準確，試驗方法選用C30色譜柱進行色譜分離純化，由于C30鍵合相具有比C18更長的烷基鏈，具有更好的分離效果，通過有效調節流動相比例最大限度降低基質干擾峰的影響。試驗結果表明在0.50～5.00 mg/L范圍內阿維菌素色譜峰面積與質量濃度之間有良好線性關系，準確度高，蔬菜樣品中阿維菌素0.05 mg/kg水平加標回收率可達92.8%～102.4%；重復性好，相對標準溶液偏差為1.1%～4.5%（n=6），試驗優化標準方法，降低基質干擾，具有較強的可操作性，穩定性好，可有效適用于蔬菜中阿維菌素殘留的定量分析，滿足日常檢測需求，為阿維菌素殘留量的快速檢測提供參考依據，便于在基層實驗室推廣使用，為保障果蔬質量安全檢測提供技術支撐。