QuEChERS-UPLC-MS/MS測定宣威火腿中氯霉素殘留量

賈巧莉，陳雪霞，解粉蓮，張舒婷，趙叢叢

1.曲靖市質量技術監督綜合檢測中心（曲靖 655000）；2.云南省肉制品質量監督檢驗中心（曲靖 655000）；3.曲靖師范學院（曲靖 655011）

氯霉素具有良好的抗菌作用，被廣泛用于畜禽等養殖行業，治療各種動物性疾病，對人體造血系統的毒性極大，并容易引起再生障礙性貧血癥，可損害視力，引起急性中毒性表皮松懈癥。此外，氯霉素對老年人、新生兒、早產兒以及肝腎功能不全人群的影響更大[1-2]。GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規定氯霉素不得檢出[3]，但由于其生產工藝簡單、價格低廉、抑菌效果好，在養殖過程中的使用仍屢禁不止。宣威火腿以生長于云南滇東高原，長得膘肥肉厚的宣威生豬前腿或后腿為原料，以食鹽為主要腌制劑，傳統干腌火腿工藝制成，以其獨特的色、香、味、形而聞名于世[4]，從而對宣威火腿質量安全提出更高的要求，建立可靠、快速靈敏的檢測方法監測宣威火腿的氯霉素殘留量十分必要。

目前，國內外文獻研究蜂蜜、雞肉、蛋類、牛肉、水產品、乳制品中氯霉素殘留量較多[5-13]，相關文獻中，前處理方法主要采用免疫層析法[14]、液液萃取法[15]、固相萃取法[16-19]和分散固相萃取[20-21]，主要運用液相色譜儀[22-24]、液質聯用儀[25-27]，少部分運用到氣質聯用儀[28]進行檢測。鮮有針對于宣威火腿中氯霉素殘留量的檢測文獻，文章以宣威火腿作為研究基質，結合增強型脂質去凈化管（Bond Elut QuEChERS EMR-Lipid）和超高效液相色譜串聯質譜聯用的分析方法，以期為快速檢測和監管云南宣威火腿中氯霉素殘留提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宣威火腿（20批，曲靖西苑小區農貿市場、曲靖河北商貿市場）。

甲醇中的氯霉素（chloramphenicol，CAP）標準溶液（100 μg/mL，1.2 mL，壇墨質檢）；氘代氯霉素（CAP-D5）內標溶液（100 μg/mL，1.2 mL，壇墨質檢）；增強型脂質去除凈化管（5982-1010，Agilent Bond Elut-Lipid，美國安捷倫科技公司）；反萃管（5982-0101，Agilent Bond Elut EMR-Lipid Polish，美國安捷倫科技公司）；Silibase? PSA固相萃取柱（500 mg/6 mL，深圳逗點生物技術有限公司）；NH2小柱（500 mg/6 mL，美國安捷倫科技公司）；HLB小柱（500 mg/6 mL，深圳逗點生物技術有限公司）；甲酸、乙腈、乙酸銨（色譜純，美國Fisher公司）；實驗室用水為超純水。

1.2 儀器與設備

Agilent ultra LC 1290-G6460B QQQ高效液相色譜串聯質譜聯用儀（德國安捷倫公司），配電噴霧離子源（ESI）；Milli-Q Advantage A10超級純水機（美國Millipore公司）；CT15RT臺式高速大容量冷凍離心機（湖南盧湘儀儀器有限公司）；MS3 basic漩渦混勻器（德國IKA公司）；CPA225D分析天平（德國賽多利斯）；HG211-BJBLAA-1000微孔溶劑過濾器（北京百萬電子科技有限公司）；直徑50 mm，孔徑0.2 μm有機系微孔過濾膜（天津津騰科技有限公司）；XTNS1氮吹儀（上海新拓分析儀器科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

氯霉素標準工作液：將0.1 mL 100 μg/mL氯霉素標準儲備液用甲醇溶解并稀釋至10.0 mL，搖勻，質量濃度為1.0 μg/mL，再用初始流動相配制標準系列工作溶液分別為0.5，5.0，10.0，20.0，25.0和50.0 ng/mL的標準工作液。

氯霉素-D5標準工作液：取1 mL 100 μg/mL氯霉素-D5，用甲醇溶解并稀釋至10.0 mL，搖勻，作為儲備液，質量濃度為10 μg/mL，精密量取0.1 mL儲備液，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為中間液，然后精密量取2 mL儲備液，加甲醇溶解并稀釋至4 mL，搖勻，質量濃度50 ng/mL作為內標工作液。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取5 g（精確至0.01 g）均質樣品至50 mL尖底具塞塑料離心管中，加入0.2 mL 50 ng/mL內標工作液，加入5 mL超純水，渦旋30 s，準確加入10 mL 5%甲酸乙腈，渦旋分散2 min，按5 000 r/min，于4 ℃冷凍離心5 min，室溫靜置。將5 mL 5 mmol/L的乙酸銨緩沖液加入EMR-Lipid凈化管中，再移取5 mL上清液至凈化管中，立即渦旋混合1 min，使樣品充分分散，按5 000 r/min 4 ℃離心3 min，將上清液全部轉移至15 mL反萃管，渦旋混勻1 min，按6 000 r/min 4 ℃離心10 min，再移取上清液至10 mL試管中，于40 ℃水浴氮吹濃縮至近干，加入1.00 mL初始流動相復溶，過0.2 μm微孔濾膜后上機測試。

1.3.3 數據處理

將儀器采集的數據導入Agilent MassHunter Quantitative Analysis（for QQQ）定性和定量軟件進行數據處理。以待測物的保留時間作為篩查基礎，以離子對響應強度作為定性確證依據；通過內標法繪制標準曲線后，將樣品中各待測物峰面積帶入標準曲線后得到定量結果。試驗中相對標準偏差均重復測定6次。

1.3.4 超高效液相色譜及質譜條件

（1）超高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse-plus C18柱，1.8 μm，50 mm×2.1 mm；進樣量5 μL；流動相：A為超純水，B為甲醇，比例為55∶45（V/V）；流速0.3 mL/min，柱溫：40 ℃。

（2）質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負離子掃描；掃描模式：多反應監測（MRM）；霧化氣：氮氣3.0 mL/min；干燥氣：氮氣10 mL/min；碰撞氣：氮氣；噴霧電壓3 000 V，離子源溫度：320 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；駐留時間：11 ms；延遲時間3 ms；分辨率：unit。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

將質量濃度為50 ng/mL的氯霉素及氯霉素-D5打進質譜，經過調節雙重四極桿的各項參數，找到特征母離子和子離子，保留時間和質譜條件參數見表1。

表1 特征母離子和子離子，保留時間和質譜條件參數

找到目標化合物的分子離子峰。再進行母離子掃描和子離子掃描找到碎片離子信息，最后確定目標化合物，以達到質譜條件最佳，見圖1。

圖1 氯霉素及氯霉素-D5標準溶液的色譜圖和離子選擇圖

2.2 樣品前處理優化

獸藥殘留檢測采用的提取劑一般有乙酸乙酯、1%水-乙腈、1%乙酸-乙腈溶液、純乙腈、5%甲酸-乙腈提取，如GB/T 22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》[29]。試驗分別采用乙酸乙酯、1%水-乙腈、1%乙酸-乙腈溶液、純乙腈、5%甲酸-乙腈5種提取劑對宣威火腿氯霉素加標樣品進行提取，試驗發現：乙酸乙酯作為提取劑時，干擾物質比較多，經過萃取管和反萃管均不能達到凈化的目的，用純乙腈和乙腈水溶液提取時提取液顏色較深，油脂比較多。1%乙酸乙腈溶液提取液的回收率低于5%甲酸乙腈的回收率。對于云南火腿來說，在加入乙腈提取劑前加入5.0 mL的水可以提高提取率，乙腈可以與樣品充分混合，最終5%甲酸乙腈的回收率較高為92.6%，其它均低于92.6%，見圖2，故試驗采用5%甲酸乙腈為提取液。

圖2 5種提取劑對云南火腿中氯霉素回收率的影響

2.3 凈化條件的優化

查閱相關文獻，宣威火腿基質相當復雜，一方面是來自生產時添加的大量鹽等調味料，另一方面是腌制發酵過程中產生的氨基酸及其衍生物、有機酸、核酸、胺類和氨類化合物、醇類化合物、糖類化合物，生物活性多肽，脂肪酶[30]，若不去除，會給氯霉素的檢測造成一定的基質干擾，采用高效的樣品前處理方法至關重要。測定前需經過凈化后才能進行質譜分析，比較HLB小柱、NH2小柱、PSA、QuEChERS EMR-Lipid增強型脂質去除凈化管4種凈化方式。以5.0 g空白的宣威火腿樣品加入0.5 mL的50 ng/mL的標準溶液，經前處理方法處理，提取完后用4種方式分別凈化，以氯霉素回收率評價4種凈化效果。結果顯示，HLB和NH2操作過程相對繁瑣，費時費力，材料成本也相對較高，且在上樣及淋洗過程中容易產生吸附不完全而導致待測物損失，同時由于HLB小柱自身特點，對堿性多肽具有高的選擇性，對酸性多肽去除效果較弱，回收率約為65.4%；NH2小柱對磺酸根離子等強陰離子和糖類等高極性有機化合物效果，有較強的基質干擾，回收率僅為55.7%。PSA固相萃取柱去除雜質的能力有限，僅對非極性化合物和脂肪酸結構的化合物有效，并且可能在復溶的過程中產生沉淀，造成氯霉素損失，回收率約為72.5%；增強型脂質去除凈化管作為QuEChERS的改良方法，不僅具有快速、易操作的特點，對于宣威火腿樣品具有高效的凈化能力，能有效去除基質效應，回收率能達到92.1%，所以試驗選擇增強型脂質去除凈化管作為凈化方法。

2.4 液相色譜條件的確定

一般來說，在流動相中增加堿性物質可以增強ESI-模式的離子化效果，另外，乙酸銨能調節pH，起緩沖鹽作用，也有助于離子化。試驗比較了水、0.1%氨水、乙酸銨搭配甲醇或乙腈為流動相的洗脫效果，發現超純水-甲醇的洗脫效果較好，能保證氯霉素及氯霉素-D5信號穩定，目標峰峰型對稱且收窄，而且也能節約試劑成本，故試驗的流動相采用超純水-甲醇流動相組合。

2.5 方法線性范圍及檢出限

配制0.5，5.0，10.0，20.0，25.0和50.0 ng/mL 6個質量濃度點，內標質量濃度5 ng/mL，經儀器分析后，以進樣相對濃度X為橫坐標，相對峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程，見圖3。以信噪比為3（rSN=3）計算檢出限，結果顯示氯霉素相關系數R2大于0.999，試驗的樣品稱樣以5.0 g計，定容體積按1.0 mL計，結合標準曲線，氯霉素的檢出限質量濃度為0.5 ng/mL，試驗檢出限為0.06 μg/kg，定量限為0.18 μg/kg。

圖3 氯霉素校正曲線圖

2.6 回收率及精密度試驗

稱取5.0 g宣威火腿空白試樣后，按照1.3.2小節方法操作，做添加回收試驗，分別加入0.1，0.5和1.0 mL氯霉素標準中間液50 ng/mL，實際加入標準品的量為1.0，5.0和10.0 μg/kg，每份加標樣平行測試6次，試驗結果見表2。結果表明，方法的回收率為79.4%～108.7%，相對標準偏差SRSD為1.97%～5.85%，從表可看出試驗所做的分析方法的準確度、精密度均滿足要求。

表2 氯霉素回收率及相對標準偏差（n=6）

2.7 實際樣品測定

采用建立的方法對來自市場20份云南宣威火腿進行氯霉素殘留量檢測，均未發現陽性樣品。

3 結論與討論

試驗用5%甲酸乙腈進行提取，Bond Elut QuECh-ERS EMR-Lipid方式凈化，達到了很好的除雜效果，采用優化后的方法對宣威火腿中的氯霉素殘留量進行檢測，前處理簡單，提高了檢測效率，具有靈敏度高、檢出限低、基質干擾少，精密度、準確度和線性關系均能達到要求，建立宣威火腿氯霉素殘留的超高效液相色譜-串聯質譜的檢測方法，滿足對宣威火腿氯霉素殘留量監督檢測要求。

研究優化的方法對準確檢測其它類火腿或肉制品中氯霉素殘留量有重要的參考意義，但與現階段多物質獸藥殘留檢測相比，研究覆蓋面還不夠，為進一步提高檢測效率，增加方法的實用性和適用性，下一步需在該方法的基礎上，繼續加強同時檢測不同基質中氯霉素殘留和其他獸藥殘留的方法研究。