三氯生對峨眉林蛙蝌蚪的毒性效應研究

李馨雨，魏順鑫，張雨娟，鐘櫟，夏雪梅，馮俊寧，劉琦，袁潔，陳鳳儀，唐家興，陳貴英

（四川師范大學生命科學學院，成都610101）

據不完全統計，三氯生（TCS）作為一種廣譜抗菌劑，全球年產量約1 500 t，被大量添加于個人護理品（香皂、牙膏、除臭劑等）、紡織纖維（玩具、內衣等）中（Daughton，1999），因具有較強的疏水性和脂溶性，在環境中難以揮發降解（梁麗萍等，2021）。TCS 主要通過生活污水排放進入環境，現有污水處理工藝不能將其完全去除（Chenet al.，2014），近年來在湖底沉積物（Wuet al.，2015）、地表水（Yavuzet al.，2015）、污水（Zhouet al.，2015）中被頻繁檢測到，如表層水體中的質量濃度高達478 ng·L?1，沉積物中的高達 2 723 ng·L?1（Zhaoet al.，2013）。早在 2011 年我國 TCS 排放量就達到了66.1 （t張芊芊，2015）。水生生物是TCS 的主要作用對象（楊雅淇等，2019），TCS 對水生生物的毒性比其對細菌的毒性大100~1 000 倍（Chalew &Halden，2009），對水生生物個體以及在分子水平上都有毒害作用（鄭欣等，2016）。南美牛蛙Leptodac?tylus pentadactylus蝌蚪在 0.15 μg·L?1TCS 中飼養18 d 后，T3 調控的發育變形過程受到干擾（Binelliet al.，2009）；斑馬魚Danio rerio胚胎在0.5 mg·L?1TCS中培養6 d 后的孵化時間顯著延遲（Oliveiraet al.，2009）；太平洋樹蛙Pseudacris regilla幼體在30 μg·L?1TCS 中飼養7 d 后，體長和體質量發育均受到抑制（Marlattet al.，2013）。據統計，全球約有60%以上的兩棲動物正遭受滅絕的威脅（麥春蘭，2021）。

兩棲動物幼體在水中發育至完全變態，期間主要攝食浮游動植物，依靠皮膚和鰓呼吸，對水環境變化十分敏感，能夠在短時間內通過其形態、行為等對水環境變化做出響應，從而成為研究水污染的重要模式生物。峨眉山地處四川盆地西南部，為亞熱帶季風氣候，是中國重要的生物資源庫，動物資源豐富，兩棲動物種類繁多（孫子健，2021）。峨眉林蛙Rana omeimontis屬兩棲綱Am?phibian 無尾目 Anura 蛙科 Ranidae 林蛙屬Rana，廣泛分布于峨眉山報國寺、清音閣農家附近的淺水域中，其蝌蚪在水中發育至完全變態需要8個月左右，易受到農家排出的含有TCS 生活污水的影響。目前TCS影響峨眉林蛙蝌蚪的研究鮮見報道，本研究以峨眉林蛙蝌蚪（G22 期）為實驗對象，研究了TCS對蝌蚪的急性毒性和慢性毒性效應，以期為當地水資源的治理及保護提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 受試生物與材料

峨眉林蛙受精卵于2020 年10 月17 日采自峨眉山報國寺旁的溪流中。TCS 購自Sigma 公司，純度99.99%。無水乙醇購自成都市科隆化學品有限公司。

1.2 方法

峨眉林蛙受精卵于室溫（20 ℃±1 ℃）下在曝氣3 d 的自來水中培育至孵出。待卵黃吸收完全之后，利用雞蛋黃喂食3 d，然后以0.05 g/10只蝌蚪的比例喂食螺旋藻，期間晝夜交替光照12 h。

實驗用水采用曝氣3 d 的自來水。實驗期間利用螺旋藻懸液喂食蝌蚪。實驗前將TCS 用無水乙醇配置成 5 mg·mL?1TCS 母液，4 ℃保存備用。使用時按照目標濃度將TCS 母液加入500 mL 自來水中。

1.2.1 急性毒性實驗室溫（20 ℃±1 ℃）下，采用半靜態換水法進行預實驗，根據致死濃度和零死亡濃度，結合等間距原則將TCS 設置為13個濃度處理組（150 μg·L?1、200 μg·L?1、250 μg·L?1、300 μg·L?1、350 μg·L?1、400 μg·L?1、450 μg·L?1、500 μg·L?1、550 μg·L?1、600 μg·L?1、650 μg·L?1、700 μg·L?1和750 μg·L?1），另設空白對照組與乙醇對照組，乙醇對照組的乙醇濃度與750 μg·L?1相當，每組3 個平行。實驗開始時隨機投入15 只大小一致的蝌蚪（G22期）于500 mL 實驗液中，實驗期間晝夜交替光照12 h，每隔24 h 換水投毒投料，記錄蝌蚪的死亡狀況，并清除死亡個體。

1.2.2 慢性毒性實驗根據急性毒性實驗結果，在死亡率最低濃度下設置慢性毒性實驗TCS 濃度（10 μg·L?1、30 μg·L?1、60 μg·L?1、90 μg·L?1、120 μg·L?1），另設空白對照組，每組3個平行。實驗前每組隨機投入18只大小一致的蝌蚪（G22期）于500 mL實驗液中，實驗期間晝夜交替光照12 h，每24 h 換水投毒投料。分別于0 d、7 d、14 d、21 d 測量蝌蚪生長發育的主要形態量度指標，包括體質量、全長、頭體長、尾長、吻長、眼間距（費梁等，2012），并利用體視鏡觀察組織器官發育（肝臟、心臟、鰓等）的情況。

1.2.3 統計分析急性毒性實驗數據使用Excel 2019 和Probit 分別進行數據整理和回歸分析，建立“劑量-效應”線性方程，得到24 h、48 h、72 h、96 h 的半致死濃度（LC50）。蝌蚪存活安全濃度（SC）=48 h LC50×0.3（/24 h LC50/48h LC50）（2程劍等，2020）。

慢性毒性實驗數據使用Excel 2019 進行統計整理，并用SPSS 19.0 處理。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較0 d、7 d、14 d、21 d 空白對照組與實驗組蝌蚪的體質量、全長、頭體長、尾長、吻長、眼間距。為了減小初始形態量度指標對結果造成誤差，進一步分析了以上形態量度指標每周增長量間的差異。顯著性水平設為α=0.05。

2 結果

2.1 急性毒性實驗結果

空白對照組與乙醇對照組的死亡率為0，因此排除乙醇溶劑對蝌蚪死亡率的影響。蝌蚪暴露24 h時，150 μg·L?1、400 μg·L?1、450 μg·L?1、600 μg·L?1、650 μg·L?1、700 μg·L?1、750 μg·L?1濃度組出現死亡，750 μg·L?1濃度組全部死亡，表現為腹部發白、尾部卷曲、下沉；48 h 時，300 μg·L?1、350 μg·L?1、500 μg·L?1、550 μg·L?1濃度組出現死亡，600 μg·L?1和 700 μg·L?1濃度組全部死亡；72 h時，200 μg·L?1、250 μg·L?1濃度組出現死亡，400 μg·L?1、450 μg·L?1、500 μg·L?1、550 μg·L?1、650 μg·L?1濃度組全部死亡 ；96 h 后 ，150 μg·L?1濃 度 組 的 死 亡 率 最 低（2.2%）（表1）。

表1 不同三氯生濃度下峨眉林蛙蝌蚪的死亡率Table 1 Mortality of Rana omeimontis tadpoles by different concentrations of triclosan

利用Probit 建立線性方程，結果顯示，LC50分 別 為 613 μg·L?1（24 h）、482 μg·L?1（48 h）、289 μg·L?1（72 h）和 266 μg·L?1（96 h），96 h-SC為 89 μg·L?1（表 2）。

表2 急性毒性實驗線性方程Table 2 Linear equation of acute toxicity test

2.2 慢性毒性實驗結果

2.2.1 峨眉林蛙蝌蚪組織器官發育（肝臟、心臟、鰓）比較觀察暴露21 d，空白對照組、10 μg·L?1、30 μg·L?1、60 μg·L?1濃度組進入 G25 期，鰓蓋褶生長發育至全部遮蓋外鰓，心臟為暗紅色、形狀清晰，皮膚顏色逐漸加深（圖 1）。90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度組進入G24 期，與同期空白對照組相比，鰓泛紅充血，心臟較小且泛紅充血，肝臟未見異常。

圖1 空白對照組峨眉林蛙蝌蚪（G25期）背面、腹面Fig. 1 Dorsal and ventral views of Rana omeimontis tadpoles（G25 stage）

2.2.2 峨眉林蛙蝌蚪形態量度指標每周結果比較暴露前，30 μg·L?1濃度組的體質量極顯著大于空白對照組（P<0.01）；暴露7 d，10 μg·L?1濃度組的體質量、眼間距，30 μg·L?1濃度組的體質量，90μg·L?1和120 μg·L?1濃度組的吻長均顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）大于空白對照組；14 d 時，10 μg·L?1濃度組的體質量、吻長均顯著（P<0.05）大于空白對照組，60 μg·L?1、90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度組的頭體長顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）小于空白對照組；21 d 時，60 μg·L?1濃度 組的 吻長 ，90 μg·L?1濃度組的體質量、頭體長，120 μg·L?1濃度組的體質量、全長、頭體長、吻長均顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）小于空白對照組（圖2）。

圖2 TCS對峨眉林蛙蝌蚪形態量度指標的影響Fig. 2 Effects of TCS on the morphological indicators of Rana omeimontis tadpoles

2.2.3 峨眉林蛙蝌蚪形態量度指標每周增長量比較暴露7 d，10μg·L?1濃度組的眼間距，60 μg·L?1、90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度組的吻長均被顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）地促進發育；14 d 時，10 μg·L?1濃度組的眼間距，60 μg·L?1濃度組的頭體長、吻長，90 μg·L?1濃度組的體質量、頭體長、吻長、眼間距，120 μg·L?1濃度組的體質量、頭體長、吻長、眼間距均被顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）地抑制發育；21 d 時，30 μg·L?1濃度組的體質量，60 μg·L?1濃度組的體質量、吻長，90 μg·L?1濃度組的體質量、吻長、眼間距，120 μg·L?1濃度組的體質量、全長、頭體長、尾長、吻長、眼間距均被顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）地抑制發育，且60 μg·L?1、90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度組的吻長發育幾乎停滯（圖3）。

圖3 TCS對峨眉林蛙蝌蚪形態量度指標每周增長量的影響Fig. 3 Effects of TCS on the changes of morphological indicators of Rana omeimontis tadpoles

3 討論

3.1 峨眉林蛙蝌蚪的急性毒性實驗

峨眉林蛙蝌蚪的急性毒性實驗96 h-LC50為266 μg·L?1，96 h-SC 為 89 μg·L?1。根 據《化 學 農藥環境安全評價試驗準則GB/T 31270.18-2014》：急性毒性實驗中，LC50<100 μg·L?1為劇毒、100~1 000 μg·L?1為高毒、1 000~10 000 μg·L?1為中毒、>10 000 μg·L?1為低毒?？芍琓CS 對于峨眉林蛙蝌蚪為高毒化合物。TCS 對黑斑蛙Pelophylax nigromaculatus蝌蚪、非洲爪蟾Xenopus laevis蝌蚪（高昆等，2016）、伍德豪斯蟾蜍Bufo woodhousii woodhousii蝌 蚪 、南 方 豹 蛙Rana sphenocephala蝌蚪、板球青蛙Acris crepitans blanchardii蝌蚪（Palen?skeet al.，2010）均為高毒化合物。

3.2 峨眉林蛙蝌蚪的慢性毒性實驗

峨眉林蛙蝌蚪的慢性毒性實驗結果顯示，90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度的 TCS 使其發育速度減 慢 ，變 態 發 育 減 緩 ；60 μg·L?1、90 μg·L?1、120 μg·L?1濃度的 TCS 對蝌蚪吻長的發育呈現前期促進、后期抑制的效應。非洲爪蟾蝌蚪經32.3 μg·L?1TCS 飼養 21 d 后，生長發育受到抑制（Fortet al.，2010），與本研究結果一致。許杰（2017）指出，中華大蟾蜍Bufo gargarizans蝌蚪（G3 期）在150 μg·L?1TCS 中暴露 40 d 后的體質量與全長發育被促進。這可能是因為不同物種對TCS 的應激不同。

TCS 能干擾水生動物的甲狀腺激素、雌激素、雄激素分泌而影響其生長發育（左超等，2020），如非洲爪蟾蝌蚪經TCS慢性暴露21 d后，甲狀腺受體TR-β 的表達受到影響（Fortet al.，2010）；非洲爪蟾（G46 期）飼養在TCS 中一段時間后，甲狀腺發育被抑制（高昆，2016）。由此推測，本研究中TCS 對峨眉林蛙蝌蚪生長發育的影響可能是通過影響其相關激素水平或其受體表達，具體原因有待進一步深入研究。

TCS的危害研究集中在急性致死、慢性影響甲狀腺激素和生殖激素，以及體外細胞毒性效應：高濃度（一般300~800 μg·L?1）對魚類、兩棲類等均有致死、致畸效應（Binelliet al.，2009；Nassefet al.，2010；高昆等，2016）。低濃度（一般10~150 μg·L?1）對魚類（Kimet al.，2015；閆亮等，2018；張靈等，2019）、兩 棲 類（Fortet al.，2010；Palenskeet al.，2010；Marlattet al.，2013；許杰，2017）表現出一定的毒性，影響其相關激素水平。甚至人類血漿和母乳中均有較高的檢出率，具有較高的潛在生態風險（Adolfsson-Ericiet al.，2002；高海萍等，2012；Chenet al.，2014；楊雅淇等，2019）?？茖W使用TCS對保障動物的正常生長繁殖、生態安全、人類健康都具有重要意義。