桑黃發酵液胞外多糖含量測定方法的比較及優化

謝存一 李劍梅 郭玲玲 張疏雨 朱萬芹 柴林山

（遼寧省微生物科學研究院，遼寧朝陽 122000）

桑黃Sanghuangporus是一類重要的藥用真菌，有“森林黃金”之美稱[1]。桑黃在我國具有悠久的應用歷史，在歷代本草著作中均有記載，最早可見于東漢的《神農本草經》。據《藥性論》記載：桑黃味微苦，性寒，具有治療痢疾、盜汗、血崩、脫肛瀉血、帶下、閉經、止瀉，并具有延年等功效[2?3]。隨著現代生物技術的發展，桑黃類真菌逐漸被明確富含多糖、黃酮類、萜類等活性物質，其中桑黃多糖是桑黃類真菌中一種重要的活性物質，其胞內多糖來源于菌絲體、子實體，胞外多糖大多來源于發酵液[4?6]。研究表明：桑黃多糖能促使腫瘤細胞自我毀滅，防止腫瘤細胞附著于體內并抑制轉移，抑制率為96.78%，是目前國際公認的生物抗癌天然產品中最有效的一種藥用真菌，已經成為國內外醫藥制劑與保健品行業研究與開發的熱點[7?8]。因此，對桑黃及其提取物中多糖含量的測定就顯得十分重要。目前，多糖測定方法有很多種，直接測定的高效毛細管電泳法、高效液相色譜法等在實際應用中較為受限；利用多糖的性質，在一定條件下與顯色劑發生反應的測定方法則相對簡單方便，如水楊酸法、斐林法、苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法等，其中苯酚?硫酸法與蒽酮?硫酸法應用更為廣泛[9?10]。但不同的測定方法及測定條件測定不同來源多糖表現出的準確性、穩定性、重現性有所不同。為提高桑黃多糖含量測定的準確性，筆者以桑黃Lnonotus linteu菌株S?1液體培養獲得的胞外多糖為原料，采用苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法測定桑黃發酵液胞外多糖，比較其含量及加標回收率，明確桑黃多糖測定的最適方法；并采用單因素試驗，考察顯色劑用量、顯色劑濃度、顯色時間、顯色溫度對測定結果的影響，優選其最佳測定條件，為桑黃菌株代謝產物及其產品研發、質量控制提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）菌種：桑黃菌株S?1來源于遼寧省微生物科學研究院。

（2）主要儀器：723N 可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；SpH?2102 立式雙層大容量恒溫培養搖床（上海世平實驗設備有限公司）；HFsafe?1200 生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；CKX41SF 電 子 顯 微 鏡（OLYMPUS CORPORA‐TION）；BCD?649 WADV冰箱（青島海爾股份有限公司）；LDZX?75KBS 立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）；DHG?9 240 A 電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；KQ?50B 超聲清洗機（昆山舒美超聲儀器有限公司）；GL?21M 高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）。

（3）培養基：PDA 改良培養基為馬鈴薯20%，蔗糖 2%，牛肉膏 0.8%，MgSO40.15%，KH2PO40.3%，VB110 mg/L，玉米粉0.25%，豆粉0.25%。

（4）主要試劑

葡萄糖標準溶液：稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖10.0 mg，用蒸餾水溶解，定容至100 mL，配置成0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

苯酚溶液：稱取3.0 g、4.0 g、5.0 g、6.0 g、7.0 g 重蒸苯酚置于棕色容量瓶中，分別用蒸餾水定容至100 mL，配制成質量濃度分別為3%，4%，5%，6%，7%的苯酚溶液，置于棕色試劑瓶中，備用。

蒽酮?硫酸試劑：精密稱取0.100 0 g 蒽酮，置棕色容量瓶中，用80%濃硫酸溶解并定容至100 mL，現用現配。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑黃胞外多糖溶液的制備

從PDA 斜面挑取4 塊新鮮的S?1 桑黃菌株菌絲塊（單塊約0.5 cm2）接入裝有 100 mL 的 PDA 改良培養基的三角瓶中（250 mL），于28 ℃、150 r/min 條件下搖床振蕩避光培養7 d；培養結束后，用三層紗布過濾發酵液，收集濾液，于10 ℃、14 400×g條件下離心20 min，收集上清液，然后吸取0.5 mL的上清液于250 mL 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（即為桑黃胞外多糖供試樣品液），備用。

1.2.2 不同測定方法比較

苯酚?硫酸法：準確吸取0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL于25 mL 比色管中，分別用蒸餾水將其補足至2.0 mL；加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻，迅速加入5 mL 98%濃硫酸，混勻，40 ℃水浴15 min 后迅速冷卻，于波長490 nm處測定吸光度值（A），獲得葡萄糖標準曲線方程式為：y=16.844x?0.077（R2=0.9881）；同步吸取2 mL 的桑黃菌株胞外多糖供試樣品液置于25 mL比色管中，測定供試樣品液的吸光度值，依據標準曲線方程式計算胞外多糖的質量濃度。每組測定3次，取平均值。

蒽酮?硫酸法：準確吸取0.1 mg/mL 葡萄糖標準溶液 0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL 置于25 mL 比色管中，分別補蒸餾水至2.0 mL，迅速加入蒽酮?硫酸試劑6.0 mL，沸水浴15 min 后迅速冷卻，于波長620 nm 處測定吸光度值（A），獲得葡萄糖標準曲線方程式為：y=0.008x?0.001（R2=0.987）；同步吸取2 mL 的桑黃菌株胞外多糖供試樣品液置于25 mL 比色管中，測定供試樣品液的吸光度值，依據標準曲線方程式計算胞外多糖的質量濃度。每組測定3次，取平均值。

加標回收率測定：吸取1.0 mL 桑黃胞外多糖供試樣品液3 份，分別加入0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL，分別用苯酚?硫酸法、蒽酮?硫酸法測定多糖含量，計算加標回收率并比對。

1.2.3 苯酚?硫酸法測定條件優化

1.2.3.1 濃硫酸用量的優化

移取5 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL 于25 mL比色管中，加入1 mL 5%苯酚溶液，混勻后迅速加入1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、9.0 mL 的濃硫酸，搖勻，40 ℃水浴顯色15 min，取出后迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光度值。

1.2.3.2 苯酚溶液質量濃度的優化

移取5 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL 于25 mL比色管中，分別加入1 mL 質量濃度為3%、4%、5%、6%、7%的苯酚溶液，混勻后分別迅速加入（優化用量）濃硫酸，搖勻后于40 ℃水浴顯色15 min，取出后迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光度值。

1.2.3.3 苯酚溶液用量的優化

采用優化的濃硫酸用量及苯酚質量濃度。移取5 份胞外多糖供試液2.0 mL 于25 mL 比色管中，分別加入 0.2 mL、0.6 mL、1.0 mL、1.4 mL、1.8 mL 苯酚溶液，混勻后分別于冰水浴中迅速加入濃硫酸，搖勻，40 ℃水浴顯色15 min，取出后迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光度值。

1.2.3.4 水浴顯色時間的優化

在上述優化條件下，移取6 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL于25 mL比色管中，按照1.2.3.1方法，依次加入苯酚、濃硫酸，搖勻，在優化的水浴溫度條件下分別顯色 5 min、10 min、15 min、25 min、30 min、35 min，取出后迅速冷卻至室溫，于波長490 nm 處測定吸光度值。

1.2.3.5 顯色溫度的優化

移取5 份胞外多糖供試樣品液2.0 mL 于25 mL比色管中，在優化的顯色劑用量及質量濃度條件下，按照1.2.3.1 方法，依次加入苯酚、濃硫酸，搖勻后分別在 20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴條件下顯色15 min，取出后迅速冷卻至室溫，于波長490 nm處測定吸光度值。

1.2.4 方法準確度及精密度

1.2.4.1 線性關系考察

準確吸取0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，于 25 mL 比色管中，用蒸餾水補足至2.0 mL；然后在優化的測定條件下，按照1.2.2 中的苯酚?硫酸法測定不同質量濃度葡萄糖溶液的吸光度值，以葡萄糖質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標制備標準曲線，考察優化條件下測定方法的準確度。

1.2.4.2 穩定性試驗

在優化的測定條件下，移取2.0 mL 胞外多糖供試樣品液，依次加入苯酚溶液、濃硫酸，顯色、冷卻后分別放置 5 min、10 min、15 min、30 min、60 min、90 min，于波長490 nm 處測定吸光度值，考察吸光度值變化情況。

1.2.4.3 精密度試驗

精密移取5 份2.0 mL 的胞外多糖供試樣品液，按1.2.4.1 檢測方法平行測定其吸光度值，并計算相對標準偏差。

1.2.4.4 加標回收率試驗

移取4 份1.0 mL 胞外多糖供試樣品液于25 mL比色管中，取其中的3 份，分別加入0.1 mg/mL 葡萄糖標準溶液 0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，然后分別用蒸餾水補足2 mL，按1.2.4.1 測定方法平行測定其吸光度值，計算加標回收率。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel軟件進行處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同測定方法多糖含量的測定結果

苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法均可用于測定桑黃菌株胞外多糖含量。但相比于苯酚?硫酸法[胞外多糖測定值為（22.877±0.982）mg/mL]，蒽酮?硫酸法測定的桑黃胞外多糖含量的結果值偏高，為（34.25±0.5）mg/mL。由表1 可知，蒽酮?硫酸法平均加樣回收率為114.38%，RSD 為6.21%，表明加樣回收率較差，而苯酚?硫酸法的平均加樣回收率為95.42%，RSD 為2.33%，為良好范圍值。由此可見，苯酚?硫酸法測定桑黃胞內外多糖含量比較好。

表1 兩種多糖測定方法測算結果比較

2.2 苯酚-硫酸法測定條件優化

2.2.1 濃硫酸用量的確定

由圖1 可知，溶液吸光度值隨著濃硫酸用量的增加呈現出先增高后降低的趨勢。當濃硫酸用量低于7.0 mL 內，吸光度值上升幅度較大，當濃硫酸用量為7.0 mL 時，吸光度值最高（0.908），然后隨著濃硫酸用量的增加，吸光度值小幅度下降，這主要是由于過量的濃硫酸導致多糖成分的碳化所致。因此，濃硫酸最適用量為7.0 mL。

圖1 不同濃硫酸用量測得的吸光度值

2.2.2 苯酚溶液質量濃度的確定

由圖2可知，在優化的濃硫酸用量條件下，隨著苯酚溶液的質量濃度上升，供試樣品液的吸光度值緩慢上升，當苯酚溶液質量濃度為5%時，供試樣品液的吸光度值達峰值（0.979）；然后隨著苯酚溶液質量濃度的上升，吸光度值略有下降，但下降幅度較小?？梢?，苯酚溶液的質量濃度對吸光度值影響幅度較小，苯酚溶液最適質量濃度為5%。

圖2 不同苯酚溶液質量濃度測得的吸光度值

2.2.3 苯酚溶液用量的確定

由圖3 可知，在優化的濃硫酸用量及苯酚溶液質量濃度條件下，苯酚溶液的用量對吸光度值具有顯著影響，吸光度值變化較大。其中，在苯酚溶液用量低于1.0 mL時，吸光度值呈現快速上升的趨勢，當苯酚溶液用量為1.0 mL 時，吸光度值最高（0.985），然后隨著苯酚溶液用量的上升，吸光度值呈顯著的下降趨勢。故苯酚溶液最適用量為1.0 mL。

圖3 不同苯酚溶液用量測得的吸光度值

2.2.4 顯色時間的確定

由圖4可知，在上述優化條件下，隨著顯色時間的上升，吸光度值逐漸上升，當顯色時間為15 min時，吸光度值最高（0.913），然后隨著顯色時間的延長，吸光度值呈現小幅度的下降趨勢。因此，最適顯色時間為15 min。

圖4 不同顯色時間測得的吸光度值

2.2.5 水浴顯色溫度的確定

由圖5 可知，在優化的顯色試劑用量及濃度條件下，水浴溫度對吸光度值影響較小，呈現小幅度的先上升后下降趨勢，當水浴溫度為60 ℃時，吸光度值最高（0.944）。因此，最適顯色溫度為60 ℃。

圖5 不同水浴顯色溫度測得的吸光度值

2.3 優化測定條件后的苯酚-硫酸法考察

2.3.1 標準曲線的繪制

優化測定條件下，以葡萄糖質量濃度為橫坐標，吸光度值A為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。由圖6 可知，葡萄糖質量濃度在0~100μg/mL，其與吸光度值具有良好的線性關系，所獲得的線性回歸方程為y=15.319x-0.008 8，其R2=0.999 3；表明優化后的苯酚?硫酸法具有良好的準確性。

圖6 優化后葡萄糖標準曲線方程

2.3.2 穩定性試驗

取相同供試樣品液5 份，在相同條件下測定吸光度值，結果如表2。由表2 可知，隨著顯色時間的延長，供試樣品液的吸光度值呈小幅度的先上升后下降趨勢，90 min 內的吸光度值在0.966~0.976，平均值為0.972，RSD 為0.32%，表明優化后的苯酚?硫酸測定方法穩定性良好。

表2 穩定性試驗結果

2.3.3 精密度試驗

由表3 可知，同一供試樣品溶液，在相同條件下，重復測定吸光度值5 次，所測得的吸光度平均值為0.963，相對平均偏差RSD 為1.80%。可見，所獲方法重現性良好。

表3 精密度試驗結果

2.3.4 加樣回收率

由表4 可知，在試驗范圍內，采用優化后的苯酚?硫酸法的加樣回收率在101.05%~104.88%，平均回收率為103.24%，相對平均偏差 RSD 為1.91%?？梢?，優化后的苯酚?硫酸法測定結果穩定、良好。

表4 加樣回收率結果

3 小結

以桑黃菌株S?1 胞外多糖為試驗材料，兩種方法測定多糖含量測定結果表明，苯酚?硫酸法及蒽酮?硫酸法均可直接測定桑黃菌株胞外多糖的含量，但相比之下，蒽酮?硫酸法測定胞外多糖的含量值均偏高，苯酚?硫酸法測定的結果值更為可信，且苯酚?硫酸法的加標回收率（95.42%，RSD=2.33%）較蒽酮?硫酸法（114.38%，RSD=6.21%）表現更好，是測量桑黃胞內外多糖的更優選擇。

苯酚?硫酸法測定多糖含量的原理是在濃硫酸水合產生的高溫條件下將多糖水解成單糖，而苯酚與單糖迅速脫水生成的糖衍生物發生反應，生成橙黃色化合物，再以紫外可見光分光光度計法測定[11]，方法中濃硫酸、苯酚質量濃度、苯酚溶液的用量、顯色時間、水浴溫度對吸光度值具有一定的影響。單因素優化結果表明：試驗范圍內，各因素對吸光度值的影響均呈先上升后降低的變化趨勢，最優的試驗條件：在2.0 mL 待測樣品液中，加入5%苯酚溶液1 mL，緩慢加入濃硫酸7 mL，于60 ℃水浴條件下顯色15 min；優化后的苯酚?硫酸法，0~100 μg/mL 葡萄糖質量濃度與吸光度值具有良好的線性關系，穩定性、精密度試驗的相對標準偏差（RSD）分別為0.32%、1.80%；平均加標回收率為103.24%，相對標準偏差RSD=1.91%?？梢?，優化的苯酚?硫酸法具有良好的準確度、穩定性、重現性，可作為桑黃菌株發酵液胞外多糖的測定方法。